α-シヌクレイン凝集体で処理したニューロンの免疫染色

誤

って折りたたまれたタンパク質の塊であるα-シヌクレインまたはα-S凝集体で処理された接着ニューロン培養から始めます。

これらの塊は凝集して細胞内封入体を形成します。

細胞の完全性を維持するために、培地を固定液と交換してください。

固定液を取り除き、バッファーで洗浄します。

次に、界面活性剤を加えて細胞膜を透過します。

界面活性剤を取り除き、緩衝液で洗浄します。

非特異的抗体結合を防ぐためにブロッキング溶液を導入します。

次に、α-S封入体および構造タンパク質に特異的に結合する一次抗体とインキュベートします。

バッファーで洗浄して、結合していない抗体を除去します。

蛍光標識二次抗体とインキュベートします。

結合していない抗体を除去します。

蛍光染色剤を加えて核を標識します。

汚れを取り除き、バッファーで洗います。

取り付け媒体を使用して、ニューロンを含むカバーガラスをスライドに取り付けます。

蛍光顕微鏡下で、ニューロン内の免疫標識α-S封入体を観察します。

化学ヒュームフードで免疫蛍光を行うには、PBS中の2%パラホルムアルデヒドと5%スクロース溶液でニューロンを室温で15分間振とうことなく固定します。15分後、固定液を取り除き、ニューロンをPBSで3回短時間洗浄します。

次に、PBS中の0.3%の非イオン性界面活性剤でニューロンを室温で5分間透過処理します。次に、ニューロンをPBSで3回短時間洗浄します。ニューロンをPBS中の3%FBSとともにオービタルシェーカーで室温で30分間インキュベートし、非特異的結合部位をブロックします。その後、PBS中の3%FBSに溶解した適切な一次抗体とニューロンを、冷蔵室または冷蔵庫で摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、抗体溶液を取り出し、細胞をPBSで3回短時間洗浄します。次に、PBS中の3%FBSに溶解した適切な蛍光二次抗体とニューロンを、オービタルシェーカーで暗所で室温で1時間インキュベートします。

抗体溶液を取り出し、PBSで3回短時間洗浄します。次に、オービタルシェーカーで暗所の室温でDAPI溶液で15分間ニューロンを染色します。15分後、抗体溶液を取り出し、PBSで3回短時間洗浄します。色あせ防止の取り付け媒体を使用して、カバーガラスをスライドに取り付けます。