ヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおける伸張損傷のin vitroモデル

シリコンメンブレンに取り付けられたマルチウェル底なしプレートから始めます。膜は、細胞の接着を促進するために生体高分子でコーティングされています。

培地に懸濁したヒト人工多能性幹細胞由来ニューロン(hiPSCN)をウェルに導入します。培地には、細胞外マトリックスまたはECMタンパク質が添加され、細胞接着が強化されます。

プレートをインキュベートすると、細胞が ECM タンパク質と生体ポリマーに付着し、膜表面との均一な相互作用が促進されます。

次に、プレートを傷害装置のステージに固定します。

この装置を使用して、膜にくぼみを適用し、ニューロンに制御された機械的ストレスを生成します。

ストレスは細胞骨格を破壊し、神経突起と呼ばれる細胞突起の変性と神経突起に沿った小さな腫れの形成を引き起こします。

ストレスはまた、細胞膜の完全性を損傷し、細胞死を引き起こします。

伸張性損傷の表現型を示すhiPSCNは、分析の準備が整いました。

プレートをストレッチするには、「ポジショントラッキング」バーチャルインストゥルメントの「ファイル名」と「ファイルパス」フィールドを一意のファイル名に変更し、「実行」矢印をクリックします。ムーブメントコントロールパネルの仮想計器の「怪我」および「怪我の期間」フィールドで、くぼみの深さと持続時間を設定します。プレートをゼロ位置にした状態で、仮想計器「移動コントロールパネル」を実行し、「損傷」をクリックしてプレートをくぼまします。

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上]をクリックしてステージを上に移動し、プレートが一番上の位置になったら[停止]をクリックし、ドアを開けて負傷装置を無効にします。次に、仮想計測器「Position Tracker」に表示されるステージの変位履歴を調べて、指定された最大変位が適用されたことを確認し、データを適切なスプレッドシートプログラムにエクスポートします。

プラズマ処理後のシリコーン膜の伸び性を評価するには、プレートを柔らかい表面に置き、油性マーカーペンのインクでスタンプの小さな突起を下塗りします。スタンプをテストする最初のウェルに挿入し、タップしてインクが良好に転写されるようにします。すべての井戸が刻印されたら、高速度カメラを傷害装置の上のブームスタンドに置き、レンズを最小の番号のFストップに設定して、視野に3×4のグリッドに12個の圧子が含まれるようにします。

プレートをゼロ点の位置にした状態で、カメラソフトウェアの[記録]ボタンを1回クリックして「トリガーイン」と表示され、明るく拡散する軸方向光をオンにし、先ほど示したようにプレートをくぼませ、軸方向光をオフにします。

細胞培養を損傷するには、100マイクロリットルのラミニン処理ヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンを血漿処理プレートの各ウェルに加え、細胞を室温で15分間プレート底部に付着させてから、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。培養2〜3日後、プレートを損傷装置ステージにクランプし、蓋の位置を調整して、培養物を周囲の空気にさらさせずにプレートを固定します。次に、プレートをゼロ点の位置にした状態で、先ほど示したようにプレートをくぼまします。