リアルタイム環状アデノシン一リン酸アッセイを用いた匂い物質受容体活性化の測定

トランスフェクトされた哺乳類細胞を含むマルチウェルプレートを取ります。

これらの細胞は、Gタンパク質共役受容体である嗅覚ニューロンの匂い受容体(OR)と、変異ルシフェラーゼに融合したcAMP結合ドメインを含むcAMPバイオセンサーを発現します。

培地を取り出し、バッファーで洗浄して残留培地を除去します。

cAMPバイオセンサー基質を含むバッファーを追加します。細胞への基質の取り込みを促進するためにインキュベートします。

化学発光プレートリーダーを使用して、細胞の基礎発光を測定します。

濃度

の高い試験臭気剤をウェルに追加し、コントロールとして1つのウェルを未処理のままにします。

臭気物質は OR に結合し、cAMP を生成するシグナル伝達カスケードを引き起こします。

このcAMPはバイオセンサーの結合ドメインに結合し、ルシフェラーゼを活性化し、ルシフェラーゼは基質と相互作用して発光します。

リアルタイムで発光を測定します。臭気物質濃度が高いほど発光が増加すると、臭気物質によるOR活性化を示します。

刺激する前に、位相差顕微鏡でトランスフェクトされた細胞を観察し、インキュベーターに戻る前にウェルあたり50%から80%の適切なコンフルエンスを確認します。次に、10ミリモルのHEPESと5ミリモルのグルコースをハンクの平衡塩溶液に加えて刺激培地を調製します。リアルタイムサイクリックAMPアッセイ基質試薬アリコートの55マイクロリットルのアリコートを氷上で解凍します。

55マイクロリットルの基質試薬と2,750マイクロリットルの刺激培地を混合して、2%平衡溶液を調製します。ベンチにペーパータオルを厚く広げた後、ペーパータオルの上でプレートを逆さまに軽く繰り返し軽く叩き、トランスフェクション培地がペーパータオルに吸収されるようにします。各ウェルに50マイクロリットルの刺激培地をピペッティングして細胞を洗浄します。

96ウェルプレートから刺激培地を優しく繰り返しタップアウトします。25マイクロリットルの2%平衡化溶液を各ウェルにピペットで入れ、室温で暗所で2時間インキュベートします。インキュベーション時間が終了する前に、解凍した臭気原液を刺激培地中で作業濃度まで希釈します。

臭気剤を添加する前に、化学発光プレートリーダーを使用してプレートの基礎発光レベルを測定します。プレートリーダーからプレートをすばやく取り外し、各ウェルに25マイクロリットルの臭気剤希釈液を追加します。その後、30分以内に20サイクルの連続発光測定を直ちに開始します。