胚性マウス消化管におけるニューロン集団の免疫蛍光染色

所望の発達段階で固定されたトランスジェニック胚マウス消化管を取ります。

消化管の腸神経系には、腸ニューロンとコリンアセチルトランスフェラーゼを発現するコリン作動性ニューロンが含まれます。

これらのコリン作動性ニューロンは、コリンアセチルトランスフェラーゼプロモーターによって駆動される蛍光タンパク質も発現します。

非イオン性界面活性剤およびタンパク質で管をインキュベートして細胞を透過性化し、非特異的抗体結合を防ぎます。

一次抗体に置き換えます。抗体がそれぞれニューロンの標的タンパク質に結合するようにインキュベートします。

結合していない抗体を取り除き、バッファーで洗浄します。

蛍光色素結合二次抗体とインキュベートして、標的タンパク質に結合した一次抗体に特異的に結合します。

余分な抗体を取り除き、バッファーで洗浄します。

標識されたトラクトを核色素を含む封入培地に浸して、核を染色します。次に、カバーガラスを取り付けます。

共焦点顕微鏡を使用して、消化管内のコリン作動性ニューロンの分布を視覚化および分析します。

消化管を、1x PBS、3%ウシ血清アルブミン、0.1 Triton X-100からなるブロッキング溶液を含む0.2ミリリットルのチューブに入れ、室温で1時間揺らします。ブロッキング後、先端の細いパスツールピペットでブロッキング溶液を吸引し、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体の最適な希釈液に置き換えます。

室温で4時間、またはロッキングプラットフォームで摂氏4度で一晩インキュベートします。一次抗体のインキュベーションに続いて、抗体溶液を吸引し、消化管をPBSで3回、それぞれ5分間すすぎ、次に室温で1時間揺ら

しながらすすぎます。

最後の洗浄後、PBSをブロッキング溶液で希釈した蛍光色素結合二次抗体と交換し、チューブを暗所のロッキングプラットフォームに室温で4時間、または摂氏4度で一晩

置きます。

以前のように消化管を洗浄した後、DAPIを含む蛍光封入剤をスライドガラスに数滴垂らし、消化管を封入剤に浸し、カバーガラスを追加します。最後に、共焦点顕微鏡を使用して各蛍光色素の画像をキャプチャし、適切なソフトウェアを使用してコンピューター支援画像解析を実行します。