トランスジェニック線虫におけるプリオン様タンパク質の細胞間拡散をモニタリングするためのタイムラプスイメージング

同じ発生段階で維持されているトランスジェニック線虫を取り上げます。

これらの線虫の体壁筋細胞は、赤色蛍光タンパク質でタグ付けされ、酸性小胞内に局在するプリオン様タンパク質を発現します。

プリオン様タンパク質は、神経変性疾患に関連するタンパク質を誤って折りたたまれ、

凝集しています。

次に、線虫を高分子ナノ粒子と麻酔液を含むアガロースパッドに移します。

ナノ粒子と麻酔液の複合効果により、線虫はアガロースパッド上で

固定されます。 ア

ガロースパッドの上にカバーガラスを置き、密封します。

次に、アガロースパッドアセンブリと線虫を共焦点顕微鏡下に置き、適切なイメージングパラメータを設定します。

線虫内の蛍光タグ付きタンパク質のタイムラプス画像を取得して、体壁筋細胞内および体壁筋細胞間のプリオン様タンパク質の小胞輸送を監視します。

同期したC.エレガンスコントロールおよびプリオンドメイントランスジェニック株、および付属のテキストプロトコルに従って10%アガロースパッドを調製した後、3マイクロリットルの100ナノグラムのポリスチレンビーズと3マイクロリットルの4ミリモルレバミゾールをアガロースパッドにピペットで入れます。プラチナワイヤーピックを使用して、希望の年齢のワームをプレートから溶液に移し、カバーガラスを使用してカバーします。

ワームを細胞内レベルで画像化するには、スライドを共焦点顕微鏡の顕微鏡スライドホルダーに入れ、63Xまたは100X / 1.4NAのオイル対物レンズを使用します。次に、MetaMorphを開いて「多次元取得」を選択し、メインタブで「タイムラプス」と「ジャーナルの実行」のチェックボックスをオンにします。「保存」タブで、ファイルを保存するためのディレクトリフォルダを選択または作成し、ファイルに名前を割り当てます。

「波長」タブで、「YokoQuad Red」またはMRPイメージングと同等の照明を使用し、露出を100〜300ミリ秒、カメラゲインを100〜300ミリ秒に調整します。次に、「タイムラプス」タブで、「時間間隔」を 1 秒、「期間」を 5 分、「時間点の数」を 301 に設定します。

仕訳帳の「仕訳帳」タブで、「AFC SET Z HOLD」と「AFC Return to Z HOLD」を選択します。[タイプ]で「特別」を2回選択し、[初期ポイント]で「時点の開始」と「時点の終了」を選択します。セットアップが完了したら、「取得」を押します。