神経変性疾患モデリングのためのラット黒質へのウイルスベクター注入

麻酔をかけたラットを定位フレームに固定します。

頭皮を消毒し、頭蓋正中線を切開して頭蓋骨を露出させます。

蓋骨の2つの基準点であるブレグマとラムダを特定して、注射部位を特定します。

ウイルスベクター懸濁液を含むマイクロインジェクションシリンジを準備します。

ウイルスベクターは、神経変性疾患の黒質のニューロンで誤って折り畳まれて凝集するタンパク質であるα-シヌクレインをコードする導入遺伝子を運びます。

マイクロインジェクションポンプに接続された定位固定装置にシリンジを配置します。

注射部位にバリ穴を開け、脳損傷を避けます。

針で硬膜を貫通し、無菌組織で血液を洗浄します。

マイクロインジェクション針をバリ穴に挿入して黒質に到達します。

ウイルス懸濁液をゆっくりと注入し、均一に分布させます。

逆流を防ぐために少し一時停止してから、ゆっくりと針を引き抜きます。

切開部を縫合します。

で、モデルをさらに解析する準備が整いました。

承認されたプロトコルに従って、生後8週間の雌のWistarラットに適切に麻酔することから始めます。各足を絞り、離脱反射がないことに注意することにより、麻酔の外科的計画が達成されたことを確認します。次に、マイクロトランスポンダーインプラントを使用して、マイクロトランスポンダーをラットの背中に配置します。マイクロトランスポンダーが正しく配置されていること、および読み出しが得られることを確認します。

次に、ラットの頭皮の毛を切り、頭皮と耳に局所麻酔薬を塗布します。ラットを層流フードに移し、無菌技術を使用して残りの手順を実行します。イヤーバーを固定してラットを定位固定フレームに置き、続いて口と鼻のバーを固定します。体温の低下を避けるために、ラットの体を紙毛布で覆います。目の乾燥を防ぐために眼の潤滑剤を塗布します。

次に、承認された手順に従って頭皮を消毒します。ここでは、70%イソプロパノール中の1%ヨウ素が使用されています。頭皮の正中線に小さな切開を行った後、頭蓋骨の膜をそっとこすり落とし、生理食塩水ですすいでください。頭蓋骨を乾かした後、ブレグマとラムダがはっきりと見えることを確認します。

次に、10マイクロリットル、30ゲージの20ミリメートルのマイクロインジェクションシリンジに組換えAAVを充填し、定位固定装置に接続された電動マイクロインジェクションポンプに置きます。

黒質のドーパミン作動性ニューロンの特異的形質導入には、力価が高く、ドーパミン作動性ニューロンを形質導入する効率が高いため、組換えAAVベクターが第一選択です。

AAVを一滴放出してフローをテストします。放出されたAAVは、多価洗浄用洗剤に廃棄してください。ヘッドがヘッドフレームにまっすぐ固定されていることを目視で確認します。次に、最初に針の先端をブレグマに移動し、頭蓋骨に触れるまで針の先端を背腹方向に下げてこの時点での高さを測定して、頭蓋骨が平らであることを確認します。ラムダで手順を繰り返します。

針を前葉に戻した後、針を前後方向と中外側方向に動かして、マイクロインジェクションのために定位座標に移動します。座標を書き留めます。注射部位では、以前と同様に頭蓋骨の高さを測定し、ブレグマの高さから0.3ミリメートル以上差がないことを確認します。

次に、頭蓋骨に2ミリメートルの穴を慎重に開けます。穴を開けたら、硬膜の高さを測定して、背腹座標を適用する基準を決定します。26ゲージの針を使用して硬膜を貫通します。無菌組織で血液を吸収し、すべての出血が止まった後にのみ続行します。

次に、プリロードされたマイクロインジェクションシリンジの針を背側腹側座標まで脳にゆっくりと下げ、1分間停止します。次に、毎分0.25マイクロリットルの速度で3マイクロリットルのAAVを注入します。注射後、針をゆっくりと取り除く前に、針の跡に沿った逆流を防ぐために、針をさらに 5 分間所定の位置に留めます。

コーティングされた編組ポリエステル3.0を使用して頭皮を縫い合わせ、70%イソプロパノール中の1%ヨウ素で皮膚を消毒して鼻と口のバーを緩め、次に2つのイヤーバーをそっと定位器具から動物を取り除きます。このとき、鎮痛剤を投与し、必要に応じて麻酔逆転剤を投与する。次に、ラットを摂氏38度に設定された加熱プレートの上の清潔なケージに入れ、目覚めるまで注意深く監視します。