ヒト死後脳組織からの界面活性剤不溶性タンパク質凝集体の単離

された神経変性疾患の症例からの凍結死後のヒト脳組織サンプルから始めます。

の特徴である不溶性タンパク質凝集体が豊富な灰白質を切除します。

組織をホモジナイザーに移します。

阻害剤を含むバッファーを加え、均質化して細胞内成分を放出します。

阻害剤はプロテアーゼとホスファターゼ酵素をブロックし、タンパク質の分解を防ぎます。

ホモジネートをチューブに移し、イオン性界面活性剤バッファーを加えます。インキュベート。

界面活性剤は、ネイティブに折りたたまれたタンパク質を可溶化しますが、誤って折りたたまれたタンパク質凝集体は無傷のままです。

超音波処理して細胞解離を完了します。

ホモジネートを超遠心チューブに移し、高速で遠心分離します。

骨材は底に沈殿します。

界面活性物質可溶性タンパク質を含む上清を取り除きます。

凝集体をイオン性界面活性剤緩衝液で洗浄し、遠心分離し、上清を除去します。

尿素緩衝液を加えてタンパク質凝集体を変性させ、可溶性にします。

可溶化したタンパク質凝集体をチューブに移し、完全に溶解するように短時間超音波処理します。

健康な対照および病理学的に確認されたADから凍結された死後脳組織を採取します。鉗子とカミソリの刃を使用して、各組織サンプルから約250ミリグラムの灰白質を切除します。脳セグメントを1分間解凍させます。次に、解凍するときに組織を約2ミリメートルの立方体にさいの目に切ります。氷上の2ミリリットルの予冷ダウンスホモジナイザーチューブに移します。

白質や大きな血管を避けることを忘れないでください。

素早く作業し、ティッシュを涙の使い捨て計量ボートに置きます。脳組織の入った計量ボートをドライアイスの入ったポリスチレン容器に頻繁に入れて、組織が解凍しないように注意してください。必要なすべての組織片を解剖して計量した後、ドライアイスから組織片を含む計量ボートを取り出します。

次に、組織1グラムあたり5ミリリットルのプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含む氷冷低塩緩衝液を加え、約10ストロークの高クリアランス乳棒Aと15ストロークの低クリアランス乳棒Bを使用して氷上で均質化します。次に、9インチのガラス製パスツールピペットを使用して、各ホモジネートをラベル付きの2ミリリットルのポリプロピレンチューブに移します。残りのホモジネートを、摂氏-80度で保管するために、同様の方法で追加の標識付き1.5ミリリットルチューブに分注します。

分別を続行するには、100マイクロリットルの5モル塩化ナトリウムと100マイクロリットルの10%サルコシルを各0.8ミリメートルのアリコートに加えます。反転してよく混ぜてから、氷上で15分間インキュベートします。インキュベーション後、マイクロチッププローブを備えた超音波処理器を使用して、30%の振幅で3つの5秒パルスを送達します。

ビシンコニン酸法を使用してホモジネートのタンパク質濃度を測定した後、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む氷冷サークバッファーを各サンプルに添加し、最終濃度は10ミリグラム/ミリメートルになります。次に、各サンプル500マイクロリットルを500マイクロリットルのポリカーボネート超遠心チューブに移します。

チューブを事前に冷却したローターにロードし、摂氏4度で30分間、180,000倍gで超遠心分離します。遠心分離後、S1サルコシル可溶性上清を1.5ミリリットルチューブに移し、摂氏-80度で保存します。界面活性剤の不溶性P1画分を含む超遠心チューブに200マイクロリットルのサークバッファーを加え、ピペットチップを使用して超遠心チューブの底からペレットを取り除きます。

次に、再懸濁したP1ペレットを新しい500マイクロリットルの超遠心チューブに移し、ペアバランスをとり、摂氏4度でさらに30分間、180,000倍gで遠心分離します。S2上清を廃棄し、次に50〜75マイクロリットルのプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含む尿素緩衝液をサルコシル不溶性ペレットに加え、室温で30分間インキュベートしてP2ペレットを可溶化します。

インキュベーション後、再懸濁したP2ペレットを標識された0.5ミリメートルチューブに移し、20%振幅で短い1秒間のマイクロチップ超音波処理を使用してペレットを完全に可溶化します。BCAアッセイ法を使用して、サルコシル可溶性画分とサルコシル不溶性画分のタンパク質濃度を測定します。