食餌性肥満ゼブラフィッシュにおけるオレキシンとカンナビノイド受容体の共局在の検出

ゼブラフィッシュの脳では、ニューロンは代謝を調節するオレキシンとカンナビノイド受容体を発現します。

食事誘発性肥満(DIO)ゼブラフィッシュでは、これらの受容体がますます共局在してヘテロマーを形成し、下流のシグナル伝達を変化させ、代謝調節に影響を与えます。

対照ゼブラフィッシュとDIOゼブラフィッシュの両方から脳組織の凍結切片を取ります。切片をバッファーで洗浄して、包埋培地を除去します。

透過処理ブロッキングバッファーで処理して、細胞膜を透過処理し、非特異的結合部位をマスクします。洗浄して余分なバッファーを取り除きます。

受容体を標的とする一次抗体カクテルでインキュベートします。結合していない抗体を洗浄して除去します。

一次抗体に結合する異なる蛍光色素標識二次抗体とインキュベートします。結合していない抗体を洗浄して除去します。

蛍光DNA結合色素を加えて核を標識します。次に、封入剤を塗布し、カバーガラスでセクションを密封します。

共焦点顕微鏡を使用して、抗体の蛍光を検出します。対照と比較してDIOゼブラフィッシュにおける抗体の共局在化の増加は、より高い受容体ヘテロマー化を示しています。

まず、切片を0.1モルのリン酸緩衝液でそれぞれ5分間3回すすぎます。一次抗体の混合物をルテチウムPBTに加え、切片を湿った箱の中で室温で一晩インキュベートします。翌日、切片を0.1モルのリン酸緩衝液でそれぞれ5分間3回すすぎます。PBTで希釈した二次抗体の適切な混合物で切片を室温で2時間インキュベートします。

切片を0.1モルのリン酸緩衝液でそれぞれ5分間3回すすぎます。1.5マイクロリットルのDAPIを3ミリリットルのリン酸塩緩衝液に溶解して、核色素DAPIを調製します。色素の切片を対比染色し、封入剤を使用してスライドをカバースリップし、組織を安定させ、長期使用のために染色します。蛍光サンプルは摂氏4度の暗所で保存できます。