初代胚性マウスドーパミンニューロンにおけるα-シヌクレイン蓄積の研究

初代胚マウスドーパミンニューロンのマイクロアイランド培養を培地を含むマルチウェルプレートに収めます。

これらのニューロンは、α-シヌクレインタンパク質の誤って折りたたまれて凝集した形態である事前に形成されたフィブリル(PFF)で前処理されています。

PFF はシードとして作用し、内因性 α-シヌクレインのさらなるミスフォールディングとオリゴマー化を引き起こし、リン酸化 α-シヌクレイン原線維を形成します。これらの原線維は最終的にレビー小体を形成します。

細胞形態を維持するために、培地を固定剤に交換します。

細胞をバッファーで洗浄します。

細胞膜を透過性化するために界面活性剤を含む緩衝液を導入します。

非特異的抗体結合を防ぐためにブロッキング溶液を追加します。

リン

酸化α-シヌクレインを標的とする一次抗体と、ドーパミンニューロンで遍在的に発現する参照タンパク質を追加します。

結合していない抗体を洗浄して除去します。

それぞれの一次抗体を標的とする蛍光色素結合二次抗体を導入します。

結合

していない抗体を除去するために再度洗浄します。

DNA結合色素を加えて核を染色します。

蛍光プレートスキャナーを使用して、細胞質α-シヌクレイン凝集体を含むドーパミンニューロンを定量します。

3.75マイクロリットルの100マイクログラムの予め形成されたフィブリルを各実験ウェルに追加し、3.75マイクロリットルのPBSを各コントロールウェルに追加します。

PFFを扱うときは、不要なタンパク質汚染に注意し、その後、フードとすべてのPFF関連機器を1%SDSと70%エタノールで洗浄してください。

適切な実験エンドポイントで、目的のマーカーを染色した後、96ウェル培養プレートを10倍対物レンズを取り付けたハイコンテントプレートスキャナーにロードします。プレートの種類、メーカー、サイズ、ウェル間の距離、培地の種類と容量など、96ウェルプレートの仕様に従って設定を調整します。

各マイクロアイランドのすべての細胞をカバーするウェルのイメージング領域を選択し、1つのウェルを使用してDAPI発現のオートフォーカスを調整します。コントロールウェルの染色強度に基づいて、各蛍光チャネルの取得時間を較正し、細胞体内にホスホセリン129アルファシヌクレイン凝集体を保有する、事前に形成されたフィブリル処理コントロールウェルのドーパミン細胞が明確に区別されるようにパラメータを調整し、ホスホセリンαシヌクレイン陽性細胞と陰性細胞の明確な定量を可能にします。

次に、各ウェルにまったく同じパラメーターを使用して、選択したすべてのウェルをすべてのチャネルで同時に画像化します。