ラット海馬切片における介在ニューロンの免疫染色

ビオチン結合分子であるビオシチンで満たされた介在ニューロンを含む固定ラット海馬切片を取ります。

次に、ブロッキングタンパク質と非イオン性界面活性剤を含む溶液を加えて、非特異的結合を防ぎ、ニューロンを透過します。

介在ニューロン上の特定のカンナビノイド受容体を標的とする一次抗体とインキュベートします。

余分な抗体を除去するためにバッファーで洗浄します。

次に、ストレプトアビジン結合蛍光色素と蛍光色素結合二次抗体を追加します。

インキュベーション中、ストレプトアビジンはバイオサイトチンに強く結合し、バイオサイトチンで満たされた介在ニューロンの視覚化を可能にしますが、二次抗体は介在ニューロン上の受容体結合一次抗体を標的とします。

緩衝液ですすぎ、結合していない分子を除去します。

次に、水性封入媒体を使用してセクションをマウントします。カバーガラスを配置して密封します。

蛍光顕微鏡を使用して、バイオサイトンで満たされた介在ニューロンとカンナビノイド受容体の発現を視覚化し、介在ニューロンの形態と受容体分布の分析を可能にします。

室温で1時間、10%ブロッキング血清で組織をロックします。続いて、一次抗体CB1Rの切片を室温で一晩インキュベートし、カンナビノイド受容体1型の発現を同定します。次に、脳切片を0.1モルPBSでそれぞれ10分間3回洗浄します。ストレプトアビジンと第一一次抗体に対する二次抗体の両方をウェルプレートに加え、摂氏4度で一晩保ちます。

続

いて、ストレプトアビジン赤色色素複合体で切片を暗闇で摂氏4度で一晩インキュベートして、バイオサイトンを明らかにします。その後、脳切片を0.1モルPBSでそれぞれ10分間3回洗浄します。蛍光を保護し、将来の再染色を容易にするために、セクションを水性ベースの封入剤にマウントし、カバーガラスの端を透明なマニキュアでシールします。