マウス脳皮質スライスにおける自発的およびオンデマンドの発作イベントの生成

皮質の興奮性錐体ニューロンで光活性化陽イオンチャネルを発現するトランスジェニックマウスの脳から皮質スライスを取ります。

スライスを記録チャンバーに固定し、人工脳脊髄液で灌流して組織の生存率を維持します。

記録電極を表層皮質層に挿入し、ベースラインのニューロン活動を記録します。

電位依存性カリウムチャネルを遮断し、カリウムの流出を防ぎ、ニューロンを過興奮状態に維持する発作誘発薬を導入します。

過興奮性ニューロンは、発作イベントと呼ばれる活動電位のバースト

発作イベントをオンデマンドで生成するには、短い光パルスを適用して、興奮性錐体ニューロンの陽イオンチャネルを活性化します。

結果として生じる陽イオンの流入は活動電位を生成し、興奮性神経伝達物質の放出を引き起こします。

これらの神経伝達物質はシナプス後ニューロンの受容体に結合し、カチオンの流入を引き起こします。

流入により活動電位が爆発し、短時間発作イベントが発生します。

この手順では、脳のスライスよりわずかに大きいレンズペーパーを切り取ります。ワイドボアピペットまたはディテーリングブラシを使用して、歯科用ピンセットを使用して所定の位置に保持されている切り取ったレンズペーパーにブレインスライスを転写します。次に、ブレインスライス入りのレンズペーパーを記録室に移し、ハープスクリーンで所定の位置に固定します。

いて、記録チャンバー内の脳スライスに、摂氏35度の炭素化ACSFを毎分3ミリリットルの速度で灌流します。デジタル温度計を使用して、記録チャンバーが摂氏33〜36度であることを確認します。次に、ハミルトンシリンジを使用して、ガラス電極に10マイクロリットルのACSFを埋め戻します。

20倍の実体顕微鏡下で、手動マニピュレーターを使用して、記録ガラス電極を表層皮質層2/3に誘導します。標準ソフトウェアで脳スライスの電気的活動を表示します。電気写真による発作様活動を誘発するには、100マイクロモルで4-APを含むACSFで脳スライスを灌流します。標準ソフトウェアで脳スライスの電気的活動を表示します。

光遺伝学的マウスの脳スライスに光遺伝学的戦略を使用して電気写真的発作様イベントを生成するには、手動マニピュレーターを使用して、記録領域の真上にコア直径1,000ミクロンの光ファイバーを配置します。青色光の短いパルスを適用して、発作イベントを開始します。