タウタンパク質凝集解析のためのヒトニューロンのレンチウイルス媒介形質導入

マトリックスコーティングプレート内の成熟ヒトニューロンの接着培養から始めます。

黄色蛍光タンパク質(YFP)レポーターに融合した変異ヒトタウタンパク質をコードするレンチウイルスベクターを追加します。

レンチウイルスは特定の神経細胞表面受容体に付着し、ウイルスと宿主の膜融合とウイルスのRNAと酵素の放出を可能にします。

ウイルスRNAはDNAに逆転写されます。

ウイルスインテグラーゼはDNAを核に輸送し、宿主ゲノムへの統合を促進し、YFPタグ付き変異タウタンパク質の産生につながります。

時間が経つにつれて、変異タウは形質導入された細胞に細胞質凝集体を形成します。

細胞を新鮮な培地で洗浄して、内在化されていないウイルス粒子を除去します。

定期的に培地を交換しながらインキュベーションを継続して、ニューロンの生存率を維持し、タンパク質凝集を促進します。

顕微鏡でニューロンを視覚化します。

形質導入に成功したニューロンは、蛍光YFPタグ付き変異タウタンパク質の細胞質凝集体を示します。

レンチウイルスでニューロンを形質導入するには、細胞あたり340,000形質導入可能単位の力価数を使用します。細胞培養培地中の形質導入可能な単位を必要な濃度に希釈し、細胞に添加します。

レンチウイルスを添加してから2日後、bFGFを含まない新鮮な培地で細胞を1回洗浄します。

bFGFを含まない培地で5%の二酸化炭素を含む摂氏37度で細胞の培養を続けます。形質導入後約8週間細胞を維持し、細胞培養培地を1日おきに交換するようにしてください。光学顕微鏡を使用して細胞を日常的に視覚化し、生存率を確認します。