ヒト細胞におけるγ-セクレターゼ活性を測定するためのルシフェラーゼアッセイ

成長培地中の遺伝子組み換えヒト細胞から始めます。

これらの細胞には、アミロイド前駆体タンパク質またはAPP遺伝子とルシフェラーゼ遺伝子を有するテトラサイクリン誘導系が含まれています。

テトラサイクリンを含む培地と交換し、インキュベートします。

テトラサイクリンは活性化タンパク質に結合し、活性化タンパク質はAPPプロモーターに結合します。

これにより遺伝子発現が誘導され、細胞膜に局在する前駆体タンパク質が産生されます。

β-セクレターゼ酵素はAPPを切断し、細胞膜に付着したままのフラグメントを生成します。

γ-セクレターゼはこの断片を切断し、アミロイドβペプチドを生成し、活性化因子成分を放出します。

この活性化因子は核に入り、ルシフェラーゼプロモーターに結合し、遺伝子発現を誘導し、ルシフェラーゼ酵素を産生します。

培地をルシフェラーゼ基質を含むアッセイ試薬と交換します。基質は細胞内に拡散し、ルシフェラーゼと反応して生物発光を生成します。

マイクロプレートリーダーを使用して光強度を測定し、神経病理学的状態に重要な酵素であるγセクレターゼ活性を直接反映します。

血

球計算盤でNGまたはCG細胞をカウントします。次に、細胞をウェルあたり20,000細胞で96ウェルマイクロプレートに、増殖培地中でウェルあたり200マイクロリットルの最終容量で播種します。マイクロプレートを加湿した二酸化炭素インキュベーターに移し、摂氏37度で一晩インキュベートします。一晩インキュベートした後、各ウェルから100マイクロリットルの増殖培地を除去します。

0.2%ジメチルスルホキシド、2マイクロモルCL 387、785、2マイクロモルDAPT、またはその他の関連するErbB1 / ErbB2阻害剤のいずれかを含むテトラサイクリン1ミリリットルあたり2マイクログラムを含む成長培地のウェルあたり100マイクロリットルを追加します。処理した細胞をマイクロプレートで摂氏37度で24時間インキュベートします。インキュベーション後、マイクロプレートからウェルあたり150マイクロリットルの増殖培地を除去します。

次に、ウェルあたり50マイクロリットルのルシフェラーゼアッセイ試薬を追加します。次に、マイクロプレートを発光マイクロプレートリーダーに移し、室温で5分間維持します。発光マイクロプレートリーダーに保存されている事前定義されたプログラムを使用して、ホタルルシフェラーゼが放出する発光を決定します。