ミクログリア膠芽腫共培養を用いたマトリックスベース腫瘍浸潤モデル

まず

、それぞれが異なる蛍光色素で染色された神経膠芽腫とミクログリア細胞のコールド懸濁液をコールドポリマーマトリックス溶液に加えます。

低温状態は、マトリックスの早期重合を防ぎます。

次に、混合物を培養プレート内の多孔質チャンバーインサートに移します。

イン

キュベートしてマトリックス重合を可能にし、細胞を埋め込むゲルを形成します。

無

血清培地をインサートに、血清含有増殖培地を下のウェルに加えてから、インキュベートします。

血清中の化学的要因は、血清が豊富な培地への細胞の移動を促進します。

さらに、ミクログリアは神経膠芽腫細胞と相互作用するシグナル伝達分子を分泌します。

これにより、神経膠芽腫細胞が多孔質インサートの下側への移動を促進し、腫瘍から周囲の組織への移動に似ています。

チャンバーの上部からセルを取り外します。

次に、残りの細胞を固定剤で固定し、バッファーで洗浄します。細胞の独特の蛍光は、細胞の移動を追跡するのに役立ちます。

マトリックス混合物を摂氏4度で一晩解凍します。次に、氷上の適切な培地中に10 mg / ml濃度のマトリックスを調製します。次に、前述のように、マトリックスに懸濁液として標識された細胞を回収します。次に、150マイクロリットルの容量で5番目のGL261細胞に1.5倍10、さらに50マイクロリットルの4番目のミクログリア細胞に10倍の5倍を1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブにピペットで入れます。

5

番目のGL261細胞に200マイクロリットルの容量で2回10を別の1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに加えます。マイクロフュージで細胞を120倍gで5分間回転させます。次に、細胞を氷上の200マイクロリットルのコールドマトリックスに再懸濁します。

このステップでは、フード内に製氷皿を用意することが重要です。冷蔵庫の氷の先端にチューブを保管してください。成熟ゲルの早期重合を防ぐために、すべてが冷やされていることを確認してください。

再懸濁後、50,000個の細胞を50マイクロリットルの容量で、8ミクロンの孔径チャンバーインサートの上部コンパートメントの中央にプレートします。次に、摂氏37度で30分間インキュベートして重合を起こします。30分後、200マイクロリットルの無血清培地を上部チャンバーに加え、700マイクロリットルの細胞増殖培地を含む血清を下部ウェルに加えます。

48時間インキュベートした後、穏やかな吸引によってチャンバーの上部から細胞を取り除きます。以前と同じようにチャンバーを固定し、細胞をイメージングする前に固定液を500マイクロリットルの1X PBSに交換します。