JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 3:39 分 • July 8th, 2025
細胞接着を促進するために、ECMタンパク質でコーティングされたトランスウェルインサートを備えたマイクロプレートを取ります。
ヒト脳微小血管内皮細胞(HBMEC)をインサートに追加し、成長培地を下部コンパートメントに追加します。
インキュベートして、細胞が付着して単層に成長できるようにします。これらの細胞はタイトジャンクションを発現し、細胞や分子の通過を制限する血液脳関門内皮を模倣します。
培地を取り除きます。末梢血単核球(PBMC)をインサートに追加し、培地を下部コンパートメントに追加します。
インキュベートすると、PBMCリンパ球が内皮細胞と相互作用し、内皮細胞間を通過する、これは転生と呼ばれるプロセスです。
インサートの底をすすぎ、接着した移住した細胞を下部コンパートメントに集めます。
細胞定量の基準として蛍光マイクロビーズを導入します。
懸濁液をチューブに移し、遠心分離し、上清を廃棄し、蛍光色素結合抗体カクテルに再懸濁してリンパ球を標識します。
移行されたリンパ球は、フローサイトメトリーによる定量化の準備が整います。
転覆アッセイ用の細胞培養インサートを調製するには、まず、100マイクロリットルのフィブロネクチン溶液を各インサートと96ウェル平底プレートの1つのウェルに加えます。摂氏37度で3時間後、フィブロネクチン溶液を100マイクロリットルのHBMECに置き換え、600マイクロリットルの新鮮なECM-b培地を細胞培養インサートの下部コンパートメントに加えます。
次に、プレートを細胞培養インキュベーターに3〜4日間戻します。末梢血単核細胞、またはPBMCサンプルを、B27を添加したRPMI培地で10〜6細胞/ミリリットル濃度の5倍に再懸濁します。次に、コンフルエントHBMEC単層を含む適切な数の細胞培養インサートの下部および上部コンパートメントから培地を吸引し、ドナーあたり100マイクロリットルのPBMCを細胞培養インサートに加え、in vitroコントロールごとに24ウェルプレートの1ウェル
に加えます。600マイクロリットルのRPMIとB27を細胞培養インサートの下部コンパートメントに加え、500マイクロリットルをin vitroコントロールウェルに加え、プレートを細胞培養インキュベーターに6時間戻します。インキュベーションの最後に、鉗子を使用して細胞培養インサートを取り除き、膜に触れずに400マイクロリットルのPBSで底を注意深くすすぎます。
次に、20マイクロリットルのフローカウント蛍光球を実験用およびin vitroコントロールウェル内の細胞と完全に混合し、得られたPBMC懸濁液1ミリリットルを適切な対応するフローサイトメトリーチューブに移します。遠心分離によって細胞を収集し、100マイクロリットルのフローサイトメトリーバッファーに目的の蛍光色素結合抗体を各サンプルに加えます。摂氏4度で30分後、250マイクロリットルの新鮮なフローサイトメトリーバッファーで細胞を洗浄し、分析のために適切な量のフローサイトメトリーバッファーにペレットを再懸濁します。