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中大脳動脈閉塞を受け、右脳半球への血流を制限したラットを例にとります。
血液供給の減少は、脳細胞から酸素を奪い、水分調節を乱し、細胞の腫れや浮腫を引き起こし、血液脳関門の破壊につながります。
損傷した細胞は最終的に死に、梗塞ゾーンを形成します。
ラットの尾静脈に青い染料を注入して、BBBの破壊を検出します。
脳を採取し、カミソリの刃でスライスし、酸化還元染料溶液でスライスをインキュベートします。
生細胞では、色素はミトコンドリアデヒドロゲナーゼと反応して還元され、生存組織が赤くなります。
デヒドロゲナーゼ活性を欠いた梗塞領域は白いままです。
スライスをスキャンして高解像度の画像を取得します。
画像解析ソフトを使用して、青色フィルターを適用して青色の染料色を除去し、画像をグレースケールに変換します。
しきい値を適用して、健康な黒組織と梗塞した白組織を区別します。
梗塞ゾーンと脳浮腫を、影響を受けていない対側半球のパーセンテージとして計算します。
まず、ラットの脳を取り除き、2インチのコーティングされていないステンレス鋼の片刃カミソリの刃で厚さ0.009ミリメートルの水平部分を切ります。切片を0.005%TTCに入れ、摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、脳組織を顕微鏡スライドの上に置き、1,600 x 1,600 DPIの解像度で6つの脳スライスの光学スキャンを実行します。フォトエディタを使用して、画像に青いフィルターを追加します。
ソフトウェアを開いた後、画像、調整、チャンネルミキサーに移動します。出力チャンネルとして青を選択し、モノクロにチェックを入れます。次に、「OK」をクリックします。画像を JPEG ファイル形式で保存します。ImageJバージョン1.37のポリゴン選択ツールを使用して、6つの脳スライスのそれぞれの各半球を選択し、個別の画像ファイルとして保存します。
梗塞量と脳浮腫を計算するには、マクロを使用して、しきい値に基づいて画像内のピクセルを白または黒に変換します。次に、すべてのファイルを閉じ、2 番目のマクロを使用して白と黒のピクセル数を比較し、梗塞量と脳浮腫を判断します。生データをスプレッドシートにコピーします。梗塞量を計算するときは、同側と対側の大脳半球の比率を使用して組織の腫れを補正します。脳浮腫領域は、影響を受けていない対側半球の標準領域のパーセンテージとして表します。