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vitro血液脳関門に似たマウス脳微小血管内皮細胞を含むメンブレンインサートから始めます。
このインサートを、電極が埋め込まれた経内皮電気抵抗またはTEER器具ウェルに入れます。
下部コンパートメントに新鮮な培地を追加します。
電極付きの蓋をTEERウェルの上に置き、機器をインキュベーターに入れ、記録システムに接続します。
電極は、経内皮抵抗を測定するために細胞層全体に電流を生成します。
細胞間の無傷の接合タンパク質は電流の流れを妨げ、その結果、TEER値が高くなります。
機器を外して取り外します。
蓋を分解し、上部コンパートメントから培地を取り除き、事前に活性化されたT細胞を追加します。TEER測定用に機器を再組み立てします。
活性化された T 細胞は内皮細胞と相互作用し、炎症因子や細胞溶解酵素を放出し、接合部の完全性を破壊します。
この中断により電流の流れが増加し、TEER 値が低下します。
TEER測定を設定するには、TEER装置の24ウェルモジュールを層流フードに配置します。蓋を取り外し、鉗子を使用してMBMECの付いたインサートを器具に入れます。
次に、810マイクロリットルの新鮮な培地をモジュールウェルの下部コンパートメントにピペットで移します。インサートとモジュールウェルの壁の間に慎重に追加します。その後、蓋を閉め、器具をインキュベーターに入れます。機器をコンピュータに接続します。次に、計測器コントローラーの電源を入れ、ソフトウェアを開きます。
ポップアップウィンドウで、「新しい測定」を選択します。「TEERを表示」および「Cclを表示」ボックスをオンにして、「開始」を押します。最初の測定が完了したら、「結果」タブで「すべてのウェルをチェック」を選択して、すべてのTEER値とCcl値を確認します。次に、ファイルを保存します。
次に、Cclが安定しており、1平方センチメートルあたり1マイクロファラッド未満であり、TEERが最大レベルに達したときに、MBMECをT細胞と共培養する時点を選択します。絶対的なTEER値とCcl値を注意深く検査し、MBMECが十分にコンフルエント単層を発達させていないウェル
を除外します。ウェルを右クリックし、「新しい平均ウェルにウェルを追加」を選択して、残りのウェルをグループ化します。ポップアップウィンドウに名前を付け、グループ化するすべての個々のウェルに対して同じことを行います。次に、すべての平均的なウェルをチェックして、共培養前にすべてのウェルが同じ初期条件を持っていることを確認します。
「実験」タブで「一時停止」を押します。器具を外し、インキュベーターから取り出します。次に、層流フードの蓋を取り外します。続いて、上部ウェルコンパートメントのインサートから培地の一部を取り出します。150マイクロリットルの培地を慎重にピペッティングして、T細胞をMBMECに追加します。次に、機器を再接続し、「測定を再開」を押します。24時間後、「実験」タブの「停止」を押してファイルを保存します。