マウス脳のMeyner基底核における神経線維の免疫組織化学的染色

酵

素コリンアセチルトランスフェラーゼを発現する神経線維が豊富なMeynertの基底核を含む固定マウス脳切片を取ります。

この切片は、内因性ペルオキシダーゼを不活性化するために前処理されます。

細胞膜を透過性化する界面活性剤を加え、続いて非特異的抗体結合を防ぐためにブロッキング溶液を加えます。

溶液をコリンアセチルトランスフェラーゼに結合する一次抗体に置き換えます。

バッファーで洗浄して、結合していない抗体を除去します。一次抗体に結合するビオチンタグ付き二次抗体とインキュベートします。

結合していない抗体を除去し、二次抗体に結合するアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体を追加します。

余分な複合体を取り除くために洗浄します。

ペルオキシダーゼと反応して着色沈殿物を形成する発色基質を加えます。

蒸

留水ですすぎ、余分な沈殿物を取り除きます。

切片を糊化スライドに移します。

次に、エタノール濃度を上げて切片を脱水し、続いてキシレンを脱水します。

切片を取り付け、顕微鏡下で観察して、染色された神経線維を視覚化します。

組織切片の免疫組織化学的標識では、トリス緩衝生理食塩水中で0.1%Triton X-100中の10%正常ウシ血清で非特異的結合をブロックした後、摂氏4度で48時間、目的の一次抗体で切片を標識します。

インキュベーションの最後に、切片を洗浄ごとに新鮮なトリス緩衝生理食塩水で3分間3回洗浄します。続いて、適切なビオチン化二次抗体と室温で1時間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、示されているように、切片を新鮮なトリス緩衝生理食塩水で3回洗浄します。続いて、メーカーのプロトコルに従って、アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体およびDABペルオキシダーゼ基質溶液で染色します。

洗浄後、1つの脳組織サンプルのすべての切片を1つの糊化スライドに取り付けます。サンプルを自然乾燥させます。切片を脱水するには、示されているように、サンプルを希釈ごとに5分間、連続して上昇エタノール溶液に2回浸漬し、続いて10分間のキシレン洗浄を2回行います。次に、適切な封入媒体を使用して、スライド上にカバーガラスを配置します。