放射性標識ドーパミンを用いたマウス脳シナプトソームのドーパミン取り込みの測定

ドーパミントランスポーター(DAT)を含むニューロンシナプスの無傷のシナプス前終末に由来する膜結合構造であるシナプトソームをマウスの脳から採取します。

試験管にリガンドを含む緩衝液を充填し、リガンドを含む緩衝液とDAT阻害剤を基準チューブに充填します。

シナプトソームを追加します。

リガンドはドーパミン分解酵素やその他のトランスポーターを阻害し、ドーパミン分解と非特異的取り込みを防ぎます。

標識なしおよび放射性標識ドーパミンを導入します。

テスト条件では、シナプトソームDATはドーパミンを取り込みます。

参照条件では、阻害剤はDATを介したドーパミン取り込みを妨げ、バックグラウンド取り込みのみを許可します。

シナプトソームを保持するマイクロファイバーフィルターにサンプルを追加します。

結合していないドーパミンを除去するために洗浄します。

フィルターをシンチレーションチューブに移します。

放射線感受性化合物を含むシンチレーション液を加える。

チューブをシンチレーションカウンターに置きます。

ドーパミンからの放射性放出は、化合物を興奮させて発光し、これはカウンターによって測定されます。

テストデータから基準を差し引いて、シナプトソームドーパミン取り込みを測定します。

このステップでは、440マイクロリットルの取り込み緩衝液、リガンド、およびコカインを12本の指定された1.5ミリリットル微量遠心チューブに加え、440マイクロリットルの取り込み緩衝液とリガンドを残りの36本の1.5ミリリットル微量遠心チューブに加えます。6本の2ミリリットルマイクロ遠心チューブに10、5、2.5、1.25、0.62、および0.31としてラベルを付けます。次に、750マイクロリットルの取り込みバッファーとリガンドを、最も少ない数の5本の微量遠心チューブに加えます。

次に、1,455.4マイクロリットルの取り込みバッファーとリガンド、14.6マイクロリットルの非標識ドーパミン、および30マイクロリットルのトリチウム化ドーパミンを標識10のチューブに加えます。次に、750マイクロリットルの混合物を10とラベル付けされたチューブから5とラベル付けされたチューブに移します。よく混合し、750マイクロリットルの混合物をこのチューブから2.5とラベル付けされたチューブに移します。残りのチューブでこの希釈を繰り返します。

その後、ガラスマイクロファイバーフィルターを12ウェルフィルターバケットに置いた後、4ミリリットルの取り込みバッファーで事前にすすぎます。その後、10マイクロリットルのシナプトソーム膜懸濁液を、440マイクロリットルの緩衝液を含む最初の24本の1.5ミリリットル微量遠心チューブに加えます。慎重にボルテックスし、すぐにスピンダウンして、シナプトソームがバッファーに沈むようにします。