可視化のためのラット海馬スライスにおけるビオシチン充填介在ニューロンの標識

不

活性化された内因性ペルオキシダーゼを持つバイオサイトンで満たされた介在ニューロンを含む固定および透過処理されたラット海馬スライスを取ります。

西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)を含むアビジン-ビオチン複合体(ABC)を加えてインキュベートし、アビジンがバイオシチンに結合できるようにします。

バインドされていないABCを洗い流します。

発

色基質と金属エンハンサーの混合物を加えてからインキュベートします。

過酸化水素を導入してHRPを活性化し、HRPが基質を酸化して暗い沈殿物を形成し、エンハンサーがコントラストを改善します。

スライスをろ紙に移し、余分なバッファーを取り除きます。コントラストを高めるために四酸化オスミウムで処理します。

スライスをスライドに置き、マウントします。エタノール濃度を上げて脱水します。

スライスを無水エタノールとプロピレンオキシドで洗浄します。

組織に浸潤するために樹脂を追加します。

スライスをプランシェットに入れ、加熱して樹脂を重合させます。スライスをスライドに移し、カバーガラスを置き、樹脂を固めます。

光学顕微鏡を使用して、暗く染色されたバイオサイトチンで満たされた介在ニューロンを視覚化します。

切片をPBSの入った清潔なガラスバイアルに入れます。最初にアビジンビオチン複合体(ABC)で切片を少なくとも2時間インキュベートして、HRP反応生成物を増幅することにより、アビジンHRP反応を実行します。

次に、切片をPBSで3回10分間洗浄し、次にTrisバッファーで2回10分間洗浄します。最後の微量バッファー洗浄液を除去した後、ジアミノベンジジン溶液またはDAB溶液に8%塩化ニッケル溶液1滴をすばやく加えます。次に、溶液をピペットで出し入れして混合します。

そして、この溶液を1ミリリットルのセクションにすばやく加えます。この溶液中で切片を15分間インキュベートします。次に、10マイクロリットルの1%過酸化水素をDAB溶液に加えます。細胞が標識されるまで、約1〜2分間絶えず攪拌しながら暗所で反応を進行させます。

ヒュームフードに、ろ紙の小さな円をペトリ皿に入れ、PBで湿らせます。絵筆を使用してガラスバイアルからセクションを一度に 1 つずつ持ち上げ、慎重に紙の上に平らに置きます。セクションを別の湿らせたろ紙の円で覆います。そして、ティッシュペーパーを表面にそっと触れて余分な緩衝液を取り除きます。

PB中の1%四酸化オスミウムを8〜9滴トップペーパーに塗布します。皿に蓋をして、ヒュームフードに少なくとも30分間、1時間以内に保持します。セクションをすすぎ、取り付け、カバーを滑らせた後、一連の50%、70%、95%、および100%アルコール溶液で脱水します。

脱水ステップに続いて、切片をシェーカー上の100%エタノールの入ったガラスバイアルに約5分間移します。アルコール溶液をプロピレンオキシドに置き換え、5分間3回洗浄します。最後の洗浄後、約2ミリリットルのプロピレンオキシドをバイアルに入れ、樹脂を1対1の比率で加えます。

樹脂が溶解していることを確認し、セクションを 30 分間一定に攪拌したままにします。30分後、木の棒を使用して、各セクションをエポキシ樹脂を含むアルミニウム板に置き、一晩インキュベートします。翌日、プランシェットをホットプレートの上に約10分間置きます。

次に、木の棒で各セクションを持ち上げ、きれいなスライドの上に置きます。すべての切片がスライドに移されたら、解剖顕微鏡でスライドを観察してスライスの向きを確認し、切片の上にカバーガラスを置きます。摂氏56度のオーブンで48時間

硬化させます。