オリゴヌクレオチドプローブを用いたラット脳切片におけるRNA発現の研究のためのin situハイブリダイゼーション

ロトニン症候群のラットから固定脳切片を採取すると、ニューロンのセロトニン受容体RNA合成が変化します。

アルコールを使用して組織を脱水します。前処理溶液を塗布して内因性加水分解酵素を不活性化し、検出試薬との相互作用を防ぎます。

沸騰バッファーで処理して、固定誘発架橋を切断し、標的RNAを露出させます。

組織を脱水し、疎水性バリアを引き出し、溶液とインキュベートして細胞膜を透過します。

オリゴヌクレオチドプローブを加えてインキュベートし、プローブが標的RNAとハイブリダイズできるようにします。

洗浄して結合していないプローブを除去し、オリゴヌクレオチドプローブに結合するプリアンプ、アンプ、および酵素結合標識プローブを含む増幅試薬でインキュベートします。

酵素結合プローブによって加水分解され、目に見える色を生成する発色基質とインキュベートします。

キシレンで処理して組織の透明性を高め、封入剤を追加し、カバーガラスを塗布します。

顕微鏡下では、組織内の色付きの斑点が標的RNA発現の定量化に役立ちます。

この手順では、脱水のために、摂氏マイナス80度の冷凍庫に保管されている顕微鏡スライドボックス用のスライドを4枚取ります。セクションをppiB、dapB、およびht2a遺伝子のテストに割り当てます。ボールペンで印を付けてラベルを貼ります。

次に、スライドを室温で100%アルコールに5分間浸します。次に、スライドをヒュームフードで5分間乾燥させます。前処理のために、前処理の20マイクロリットルを各セクションに1つの試薬をピペットで入れます。

スライドをレジャー・トレイのラック・レールに置きます。水分トレイを水平シェーカーで低速で10分間軽く振ってください。次に、スライドを二重蒸留水で2分間2回洗浄します。スライドを450ミリリットルの前処理2試薬を含む1,000ミリリットルのビーカーに沈

次に、スライドを摂氏100度で合計5分間沸騰させて、RNA構造を復元します。その後、スライドを二重蒸留水で2回、毎回2分間洗浄します。スライドを100%アルコールに5分間入れます。

次に、スライドをヒュームフードで5分間乾燥させます。疎水性ペンを使用して、組織セクションの選択した領域の周りに円を描きます。続いて、10マイクロリットルの前処理試薬を選択した各領域にピペットで入れてプローブの浸透を高め、水分トレイを蓋で覆います。

次に、水平シェーカーを備えたハイブリダイゼーションオーブンにトレイを置きます。オーブンの温度を摂氏40度に設定し、トレイを30分間軽く振ってください。その後、スライドを二重蒸留水で2回、毎回2分間洗浄します。

このステップでは、選択した領域に10マイクロリットルのppiB、dapB、またはhtr2aプローブをピペットで移管します。次に、試薬の蒸発を防ぐために水分トレイを蓋で覆います。水平シェーカーのスライドを低速で軽く振とうと、オーブンで摂氏40度で2時間インキュベートします。

次に、スライドを洗浄バッファーで2回、毎回2分間洗浄します。選択した各領域に10マイクロリットルの増幅1試薬をピペットでかけます。スライドを振とうし、摂氏40度で30分間インキュベートします。次に、スライドを洗浄バッファーで2回、毎回2分間洗浄します。

選択した各領域に10マイクロリットルの増幅2試薬をピペットで移動します。スライドを振とうし、摂氏40度で15分間インキュベートします。その後、スライドを洗浄バッファーで2回、毎回2分間洗浄します。

選択した各領域に10マイクロリットルの増幅3試薬をピペットでかけます。スライドを振とうし、摂氏40度で30分間インキュベートします。次に、スライドを洗浄バッファーで2分間2回洗浄します。

選択した各領域に10マイクロリットルの増幅4試薬をピペットでかけます。スライドを振とうし、摂氏40度で15分間インキュベートします。次に、スライドを洗浄バッファーで2分間2回洗浄します。

選択した各領域に10マイクロリットルの増幅5試薬をピペットで移動します。スライドを振とうし、室温で30分間インキュベートします。続いて、スライドを洗浄バッファーで2分間2回洗浄します。

選択した各領域に10マイクロリットルの増幅6試薬をピペットでかけます。スライドを振とうし、室温で15分間インキュベートします。次に、スライドを洗浄バッファーで2回、毎回2分間洗浄します。

次に、選択した各領域に10マイクロリットルの赤い試薬をピペットで移します。スライドを室温の水平シェーカーの水分トレイに入れ、低速で10分間穏やかに振とう。次に、スライドを二重蒸留水で毎回10分間2回洗浄します。

スライドをオーブンで摂氏60度で15分間乾燥させます。その後、スライドをキシレンでヒュームフードに5分間置きます。次に、選択した各領域に20マイクロリットルのキシレンベースの封入剤をピペットで移し、カバーガラスで覆います。