さまざまな剛性のハイドロゲルで培養した神経堤細胞の蛍光染色

さまざまな剛性のヒドロゲルでコーティングされたカバーガラス上で増殖した付着性神経堤細胞培養物を取ります。細胞をバッファーで洗浄します。

パラホルムアルデヒドを添加して細胞を固定し、細胞の形態を維持します。

細胞を緩衝液で洗浄し、余分なパラホルムアルデヒドを除去します。

次に、非イオン性界面活性剤を加えて細胞膜を透過します。

細胞を緩衝液で洗浄し、余分な界面活性剤を取り除きます。

次に、非特異的結合を防ぐためにブロッキング溶液を導入します。

アクチンフィラメントに結合する高親和性フィラメントアクチンプローブで細胞をインキュベートします。

細胞をバッファーで洗浄し、結合していないプローブを除去します。

蛍光核色素を加えて核を染色し、バッファーで洗浄して余分な色素を除去します。

カバーガラスに封入剤を塗布し、染色した細胞を蛍光顕微鏡で調べます。

より硬いヒドロゲルで増殖した細胞は、より柔らかいヒドロゲルで増殖した細胞よりもアクチンフィラメント形成が増加し、より広がった形態を示します。

ピンセットを使用してカバーガラスを新しいプレートに搬送し、プレート上に直接増殖した細胞からの誤ったシグナルを最小限に抑えます。次に、500マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを使用して細胞を10分間固定し、室温で500マイクロリットルの0.1%Triton X-100で細胞を処理します。

15分後、250マイクロリットルの10%ロバ血清で細胞をブロックします。250マイクロリットルの10%ロバ血清に1〜400の希釈液でファロイジンで細胞をF-アクチン染色し、続いてDAPIと10分間インキュベートします。

細胞をPBSで2分間洗浄してから、各ウェルに3〜4滴の封入培地を加えます。蛍光顕微鏡で、ヒドロゲルサンプルごとに少なくとも3つのランダムフレームの画像をキャプチャし、個々のチャネルとマージされたチャネルを生成します。