化学的架橋アッセイを用いたマウス脳内の神経細胞表面タンパク質の架橋

氷

のように冷たいバッファーに単離されたマウスの脳から始めます。

腹側を上に向けて脳を脳マトリックスに移します。

カミソリの刃を挿入して、脳の前部を連続的に切断します。

後部を残して、ブレードを一緒に保持してスライスを持ち上げます。カミソリの刃を分離し、脳のスライスを上に向けて冷やした表面に置きます。

目的のスライスを選択し、目的の領域を抽出します。

組織を分割してみじん切りにします。

ミンチした組織を、化学物質BS3を添加した脳脊髄液の入ったチューブに移します。

チューブを反転させて混合し、組織を細かく砕き、回転させながらインキュベートします。

細胞膜を透過しない化学物質であるBS3は、GABA受容体などの神経表面タンパク質を架橋しますが、内部のGABA受容体は変化しません。

グリシンを加えて架橋反応を消光します。

サンプルは、表面GABA受容体レベルを評価する準備ができています。

まず、安楽死させたC57黒6Jマウスの頭蓋骨から脳を迅速に取り除きます。氷冷PBSを含むペトリ皿に10〜15秒間浸します。冷やした脳を腹側を上に向かって氷の上の脳マトリックスに入れます。脳を冠状に切断するには、嗅球と嗅柄の間の境界に最初のカミソリの刃を挿入します。3〜4本の追加のカミソリの刃を使用して、脳の前部を1ミリメートル間隔で冠状に連続的に切断します。

挿入したカミソリの刃を一緒に保持して、冠状スライスを脳マトリックスから持ち上げ、後部を残します。鉗子を使用して、カミソリの刃を互いに分離し、脳のスライスを上に向けて平らで冷えた表面に置きます。

前頭前野をサンプリングするには、嗅柄を含む最初のスライスの後ろにある2番目と3番目のスライスを選択します。ティッシュパンチまたは鉗子を使用して、目的の領域を取り除きます。冷やしたカミソリの刃にティッシュを置き、均等に2つに分けます。鉗子の細い先端を使用して、カミソリの刃で各組織を複数の垂直方向の動きで細かく刻みます。人工脳脊髄液を含む事前に冷却された標識チューブに、30マイクロリットルのBS3溶液を注ぎます。次に、すぐにみじん切りにした組織を目的のチューブに移します。

架橋反応の場合は、組織と溶液の入ったチューブを反転させて、組織の塊を細かく砕きます。サンプルを摂氏4度のチューブローテーターで30分から2時間インキュベートし、各チューブのBS3インキュベーションの開始時間を記録します。次に、78マイクロリットルの1モルグリシンで反応を急冷します。さらに摂氏4度で一定回転で10分間インキュベートし、焼入れの開始時刻と終了時刻を記録します。