ヒトの死後小脳組織からプルキンエ細胞を分離するためのレーザーキャプチャマイクロダイセクション

プルキンエ細胞、顆粒、および分子細胞層を含むヒト死後小脳組織を取ります。

部分的に凍結した包埋培地を含むクライオスタットサンプルホルダーに置きます。

メディアを完全に凍結させ、組織を固定します。

このアセンブリをクライオスタットカッティングアームに移し、組織をクライオスタット温度に順応させます。

組織をブレードに近づけ、皮質層を露出させるようにトリミングします。

ブレードの上にアンチロールプレートを置き、小脳切片を取得します。

これらの切片をメンブレンスライドに移します。

組織の固定と脱水のためにエタノール濃度を上げてインキュベートします。

次に、キシレンでインキュベートします。

スライドを乾燥させ、UVレーザーキャプチャ顕微鏡ステージに置きます。

コレクションキャップを小脳組織の上に置きます。

顕微鏡的には、プルキンエ細胞に焦点を合わせます。

レーザーを使用して、さらなる分析のためにプルキンエ細胞をキャプチャして収集します。

まず、切片化のために組織の小片を切断し、切片が約95%が小脳皮質であることを確認します。残りの組織をドライアイスまたは摂氏マイナス80度の冷凍庫に戻します。次に、ゆっくりと円を描くようにチャックの上にOCTをゆっくりと追加し始めます。チャックを覆う高さ約3ミリメートルのマウンドができるまで、OCTの層を構築します。

OCTが部分的に凍結しているが、中央にまだ液体がある場合は、組織をマウンドの上に置きます。完全に凍るまで、ティッシュをOCTの上に1〜2分間置きます。次に、凍結したOCTと組織を備えたチャックをクライオスタットカッティングアームに移します。カッティングブレードと同じ高さになるようにティッシュを調整し、ティッシュをカッティングアームに20分間置いて新しい温度に調整します。

最も重要なステップは、組織をクライオスタット切断アーム内で必要な時間順応させることです。組織が細断されると、プルキンエ細胞の視覚化は非常に困難になります。組織がより早く順応できるように、より小さくて薄い組織片を使用することをお勧めします。

この後、組織をゆっくりとブレードに近づけます。組織がブレードに到達したら、トリミングプロセスを開始します。皮質層が見えるまで、組織を2〜3回トリミングします。

次に、アンチロールプレートをクライオスタットブレードのすぐ上に配置して位置合わせします。厚さ14マイクロメートルのセクションを4〜6個カットし、適切にカットされたセクションはアンチロールプレートの下で平らになることに注意してください。カット部分をクライオスタットステージ全体に水平に合わせます。

スライドの角度を付けて、すべての組織片を同時に持ち上げます。組織を切片化した直後に、スライドを70%エタノールを入れたスライドホルダーに氷上で2分間置きます。スライドを氷上の95%エタノールを入れたスライドホルダーに45秒間移します。

次に、スライドを100%エタノールを入れたスライドホルダーに室温で2分間置きます。室温でキシレン番号1を含むスライドホルダーにスライドを3回浸します。次に、スライドをキシレン2の入ったスライドホルダーに室温で5分間置きます。スライドを清潔なドラフトに立て、少なくとも 30 分間自然乾燥させます。

まず、除染したRNaseを使用して、キャップコレクションアームの顕微鏡ステージを洗浄します。手袋をはめた手で、スライドを顕微鏡の上に置き、500マイクロリットルの不透明なキャップをコレクションアームに置きます。低倍率で、不透明なキャップを小脳組織に合わせ、キャップが接眼レンズで視覚化される領域全体を覆うようにします。

5倍から10倍の対物レンズを使用して、小脳層を視覚化します。分子層と顆粒細胞層が交差する部分にカーソルを置きます。40倍の倍率に移動し、プルキンエ細胞を視覚化します。次に、キャプチャを開始します。