$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
採取したてのマウスの脳を取り、事前に冷却したイソペンタンで急速凍結して、組織を迅速に保存します。
次に、脳を皮質側を上にして凍結した脳マトリックスに移し、スライス中に冷たい環境を維持します。
脳をマトリックス温度に平衡させます。矢状洞と横洞に沿ってマトリックスに合わせて、対称的なセクションを確保します。
冷やしたブレードを脳に挿入し、適切な位置合わせを確認します。
次に、均等に押し下げて均一な脳切片を取得します。
セクション付きのブレードを取り外し、吻側を上にして、凍ったガラス板の上に配置します。
吻側から尾側までのセクションを正しい解剖学的順序で整理します。次に、それらを分離します。
適切な脳参照を使用して、セクションから関心領域を特定して切除します。
切除した組織を下流分析のために事前に冷却したバイアルに移します。
安楽死させた成体CD-1野生型マウスから脳を摘出した後、ドライアイスで予冷した液体窒素またはイソペンタンのいずれかで組織を60秒間急速凍結し、摂氏-80度で保存します。
組織を解剖する24時間前に、解凍したフリーザーパックのスタックの上にきれいなブレインマトリックスを置き、マトリックスの側面を2つのフリーザーパックの間に挟み込み、カミソリスロットの底とパックの上部の間に約半センチメートルを残します。
断熱ボックスを上部から約5センチメートルまで氷で満たして、解剖用の凍結ガラス板をセットアップします。次に、その上に2.5センチのドライアイスを敷き、黒いビニールシートで覆います。プラスチックの上にガラス板を置き、プレートの境界の周りにドライアイスを置きます。
冷凍
庫から冷凍した脳マトリックスを取り出し、脳皮質側を上にしてマトリックスに挿入します。組織を箱内の温度に10分間平衡させ、この間は蓋を開けたままにします。冷たい鉗子を使用してマトリックス内の脳の位置を調整し、矢状洞と横洞がブロックの垂直溝と一直線になるようにします。
脳が所定の位置に着いたら、冷やしたカミソリの刃をその中心近くに置き、組織に約1ミリ押し込みます。次に、脳の両端に冷やした刃を 1 つ置き、マトリックスまで押し下げます。次に、吻側の端に冷やしたブレードを追加し始め、一度に 1 つずつスロットに入れ、組織に 1 ミリメートルほどそっと押し込みます。1ミリメートル間隔でブレードを追加し続け、尾端に向かって作業します。
すべてのブレードが所定の位置に配置されたら、指、手のひら、または鈍いもので上部を押し下げ、ゆっくりと左右に揺らして組織内を移動させます。ブレードがスロットの底に到達したら、ブレードのグループの両側をつかみ、前後に揺らしてマトリックスから解放します。
ブレードのグループを解放した後、吻側を上にしてガラス板の上に置き、スタックの隣または上部にドライアイスを置いてサンプルをさらに凍結し、分離を容易にします。次に、鋭利なエッジを下にしてスタックを置き、親指と指の間でスタックをずらしてブレードを分離します。
ガラス板上のセクションを吻側から尾側に並べ、指の間で組織を曲げるか、2番目の冷やしたブレードで分離して、組織をブレードから分離します。場合によっては、組織がブレードの両側にくっつく場合があり、吻側から尾側への向きを維持するように注意する必要があります。
解剖を開始する前に、Allen Mouse Brain Atlas または別の参考文献を開き、関心領域を特定するために必要なランドマークを見つけます。冷やした鉗子またはブレードを使用してセクションを反転させ、対象領域がセクション全体で一貫していることを確認してください。
清潔なメスまたはパンチでその部分を切り込み、金属を組織に優しくしっかりと押し込み、前後に揺らして切り込みを入れます。対象領域を収穫した後、ラベルを貼った予備冷却された1.5ミリリットルのチューブに入れ、摂氏-80度で保管します。