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凍結したラット脳組織の一部を解凍します。
バッファーを加え、組織をみじん切りにします。次に、バッファーの入ったチューブに移して混合します。
混合物を遠心分離し、上清を廃棄します。
タンパク質分解酵素溶液を組織に加え、大口径ピペットを使用して再懸濁します。
混合物をインキュベートして細胞外マトリックスを分解し、神経細胞を緩めます。
混合物を遠心分離し、上清を廃棄します。
組織断片を冷やしたバッファーに再懸濁し、繰り返しピペットで細胞を解離させます。
破片と解離していない細胞を沈殿させてから、単一細胞懸濁液を新しいチューブに移します。
細胞を氷冷のエタノールに移し、混合します。それらをインキュベートして細胞を固定し、透過処理します。
懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄します。
さらなる分析のために、神経細胞をコールドバッファーに再懸濁します。
組織をみじん切りにするには、サンプルを冷たいガラス板で1分以内に解凍してから、サンプルを1〜2滴の緩衝液A溶液で覆います。次に、カミソリの刃をプレートに対して完全に垂直に持ち、組織を直交する各方向に100回みじん切りにします。組織を完全にミンチするには、組織をバッファーAで濡らした状態に保ち、指定されたミンチの時間と方向に従うことが重要です。
組織解剖中に白質の大部分を除去し、組織を緩衝液Aで覆ったままにして、ミンチ効率を向上させ、細胞の健康を維持することが重要です。
組織が完全に処理されたら、カミソリの刃を使用して、1ミリリットルのコールドバッファーAを含む微量遠心チューブにピースを移し、チューブを3〜5回反転させて、すべてのみじん切り組織を溶液に浸します。組織断片を単一細胞懸濁液に解離するには、遠心分離によってサンプルをペレット化します。
上清を捨て、1ミリリットルの冷たい解凍した酵素溶液をマイクロチューブの内壁にゆっくりと加え、先端径の大きいピペットを使用して、各ペレット全体をすぐに吸引して4回分注し、みじん切りにした組織片を分散させます。次に、ペレットがチューブの底にくっつかないようにマイクロチューブを素早く反転させ、サンプルをエンドオーバーエンドの混合で摂氏4度で30分間インキュベートします。
消化の最後に、チューブを再度遠心分離し、0.6ミリリットルのコールドバッファーAを細胞に加えます。同じピペットチップを使用して、すぐにペレットを吸引して5回分注し、次に1.3ミリメートルのガラスピペットを選択し、それを使用してサンプルを10回穏やかに滴定します。
サンプルを氷の上に2分間置き、破片と解離していない細胞がチューブの底に沈殿できるようにします。次に、上清を新しい15ミリリットルのチューブに移します。次に、収集した上清の最初のチューブから800マイクロリットルの細胞をエタノールの最初の2つのチューブのそれぞれに移します。
チューブを反転させてサンプルを混合します。次に、サンプルを氷上に15分間置き、5分ごとに反転して混合します。インキュベーションの最後に、細胞を遠心分離します。次に、マイクロチューブの壁だけに触れ、マイクロピペットを使用して、各上清の最後の50マイクロリットルを除くすべてをゆっくりと除去します。