マウス脳組織由来細胞膜タンパク質のパルミトイル化状態の評価

マウスの脳組織から細胞膜タンパク質を採取します。

これらのタンパク質は、脂肪酸であるパルミトイル基がシステイン残基に結合して翻訳後修飾を示します。

還元バッファーを加え、高温でインキュベートして、非パルミトイル化システイン間の結合を切断し、それらを露出させます。

露出したシステインに結合するブロッキング試薬でインキュベートし、パルミトイル化システインのみを反応性に残します。

溶液を移し、クロロホルム、メタノール、脱イオン水と混合し、遠心分離してタンパク質を沈殿させ、不純物を除去します。次に、メタノールを加えて遠心分離し、残っている汚染物質を捨てます。

緩衝液を加え、超音波処理してペレットを可溶化し、遠心分離して不溶性物質を除去します。

切断試薬を塗布して、パルミトイル化システインからパルミトイル基を除去します。

クロロホルム-メタノール沈殿を繰り返し、不純物を除去します。

ブロックされていないシステインに結合するポリマーとインキュベートし、パルミトイル化タンパク質の同定に役立ちます。

クロロホルム-メタノール沈殿を繰り返し、結合していないポリマーを除去します。

離されたタンパク質のパルミトイル化状態をさらに分析するために、ペレットを再懸

まず、可溶化タンパク質を25マイクロリットルのTCEPで摂氏55度で60分間インキュベートすることにより、ジスルフィド結合を破壊します。次に、溶液を12.5マイクロリットルのNEMのストック溶液と室温で3時間インキュベートすることにより、遊離システインをブロックします。

次に、クロロホルム - メタノール沈殿のプロセスを開始します。タンパク質溶液を1.5ミリリットルのチューブからポリプロピレンまたはガラスのチューブに移し、スイングバケットローターで適度な速度で遠心分離できます。2ミリリットルのメタノールを加え、短時間ボルテックスします。1ミリリットルのクロロホルムを加え、短時間ボルテックスします。次に、1.5ミリリットルの脱イオン水を加え、再び短時間ボルテックスします。

必要に応じて、チューブを反転させて完全に混合します。サンプルを3,000倍G、摂氏25度で、スイングバケットローターで30分間遠心分離します。チューブ内の溶液の上相を慎重に取り除き、廃棄します。1.5ミリリットルのメタノールを加えます。不透明なプロテインパンケーキを断片化しないように注意しながら、チューブを穏やかに反転させて、穏やかに、しかし完全に混合します。

サンプルを3,000倍G、摂氏25度でスイングバケットローターで10分間遠心分離します。ガラス血清学的ピペットを使用して、タンパク質パンケーキを乱すことなく、溶液の最上相をできるだけ多く除去します。ペレットを1ミリリットルのメタノールで注意深くすすぎ、少なくとも10分間自然乾燥させます。

クロロホルム-メタノール沈殿が完了したら、タンパク質沈殿物を125マイクロリットルの緩衝液Aに再懸濁することにより、パルミトイルチオエステル結合の切断を開始します。新しい1.5ミリリットルチューブに移します。チューブを短時間超音波処理し、13,000倍G以上、摂氏25度で10分間遠心分離して不溶性物質を除去します。

可溶化したタンパク質を新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、375マイクロリットルのバッファーHまたはバッファーTを加えます。サンプルを室温で60分間インキュベートした後、クロロホルム-メタノール沈殿を繰り返します。保護されていないシステインにmPEGを添加するには、まず、10ミリモルTCEPを含む100マイクロリットルのバッファーAにペレットを再懸濁します。

次に、懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。25マイクロリットルのストックmPEG 5k溶液を加え、ピペッティングで混合します。室温でエンドオーバーエンド回転させてインキュベートします。60分間のインキュベーション後、クロロホルムメタノール沈殿を再度行って、取り込まれていないmPEG 5kを除去します。

13,000倍G以上、摂氏25度で10分間遠心分離します。厚い凝集性のパンケーキを避けて、前と同じように上相を慎重に取り除きます。1ミリリットルのメタノールを加え、穏やかに、しかし完全に混ぜます。13,000倍G以上、摂氏25度で10分間遠心分離します。

上清を慎重に取り除き、ペレットを1ミリリットルのメタノールですすいでください。ここでも、Gの13,000倍以上、摂氏25度で10分間遠心分離します。ペレットを自然乾燥させた後、TCEPまたは還元剤を含まない50マイクロリットルの緩衝液Aに再懸濁します。