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暗闇に適応し、麻酔をかけられ、トランスジェニックな白い目のハエを例に挙げます。
ハエは、目の光受容体にeGFPタグ付きTRPLイオンチャネルを発現します。
暗闇では、TRPLは横紋膜(光受容体の微絨毛)に局在します。
圧縮空気を使用して、フライを頭からピペットチップに押し込みます。
先端をトリミングし、フライを後方に押します。
もう一度トリミングし、頭だけが飛び出すまでフライを前方に押します。
スライドに付着したモデリング粘土で先端を固定し、目を顕微鏡対物レンズに放射状に向けるように蛍光顕微鏡ステージに置きます。
対物レンズに水を一滴加え、目に触れるまで下げます。
光受容体の画像をキャプチャします。
横紋筋、細胞体、バックグラウンドの蛍光強度を測定します。
ハエをオレンジ色の光で照らして、細胞体へのTRPL転座を誘導します。
イメージングと蛍光測定を繰り返します。
画像を比較して、照射後の横紋肌蛍光の低下を観察し、細胞体へのTRPL転座を示します。
非致死的なバリエーションのハエを準備するには、氷麻酔をかけたハエを頭から200マイクロリットルのピペットチップに移し、圧縮空気でハエを先端に向かって慎重に押します。次に、メスを使用して、ピペットの先端を頭のすぐ前で切り取ります。そしてピンセットを使用して、フライをピペットチップに数ミリメートル慎重に押し込みます。
ピペットチップを再び切り取ります。そして、圧縮空気でフライを先端に向かって押し戻し、フライの頭だけがピペットチップから突き出るようにします。粘土を物体のスライドに貼り付けた後、左目または右目が上を向くようにピペットチップを押し込みます。顕微鏡下で目の向きが正しいことを確認してください。画像取得には、水浸対物レンズを選択します。
非致死的な変動の場合は、実験用ピペットを使用して、水浸対物レンズの下側に大量の冷水を付着させます。準備したフライでオブジェクトスライドを顕微鏡ステージに慎重に置きます。次に、水面に接触するか、ハエの目が水滴に触れるまで、水浸対物レンズを手動で下げます。
次に、光路を顕微鏡カメラに切り替えて、ライブ画像を生成します。カメラの焦点を再調整し、目が顕微鏡の対物レンズを放射状に向く必要があることを考慮して、目の向きを評価します。ルックアップテーブルソフトウェアを使用して、過飽和を検出します。
色素沈着していないハエの場合は、最も明るいピクセルがすべての画像の彩度制限をわずかに下回るように露光時間を調整します。画像を記録して生ファイルとして保存し、記録の対応するすべてのメタデータをアーカイブします。次に、画像をドット TIFF 形式でエクスポートします。
水浸顕微鏡写真のラブドメアにおける相対的なEGFP蛍光を定量化するには、[分析]をクリックしてImageJ設定を調整します。次に、測定値を設定し、平均グレー値のボックスのみをオンにします。[ファイル]、[開く] の順にクリックして、ドット TIFF 画像をインポートします。焦点が合っている画像の代表的な領域を選択し、ControlとPlusを同時に繰り返し押すことで200%から300%に拡大します。
次に、楕円ツールを選択します。そして、Shiftキーを押しながら、1つの蛍光ラブドメアよりも大幅に小さい円形の選択範囲を画像に生成します。次に、ImageJ メイン ウィンドウのツールバーの下に表示されている正確なサイズを探します。円形選択範囲内の蛍光強度を測定するには、キーボードの矢印キーを使用して円を最初のラブドメアに移動し、[分析]、[測定] の順にクリックします。
測定されたグレー値をリストした結果ウィンドウがポップアップ表示されます。横紋2〜6の測定を続け、バックグラウンド信号も測定します。色素沈着していないハエの場合は、対応する細胞体領域を追加で測定します。さらに2つのオマチジアの蛍光を測定し、3つの技術的反復を行います。鉛筆ツールを使用して分析したオマチディアにマークを付け、この画像を文書化用に保存します。
結果ウィンドウから測定されたグレー値を選択してコピーし、スプレッドシート ソフトウェアに貼り付けてさらに計算します。蛍光強度の値を、その起源に応じてカテゴリのラブドメア、細胞体、およびバックグラウンドにソートし、各カテゴリから平均強度を計算します。次に、非色素性眼の場合は最初の式、色素沈着した目の場合は 2 番目の式を使用して、横紋膜に存在する EGFP の相対量を計算します。