神経変性タンパク質の過剰発現を伴う酵母細胞におけるヒストン修飾の検出

神経変性疾患に関連するタンパク質を過剰発現する酵母細胞の懸濁液から始めます。

この過剰発現タンパク質は、DNAパッケージングタンパク質または化学部分を持つヒストンの修飾の原因となります。

水酸化ナトリウムとベータ-メルカプトエタノールを加え、氷上でインキュベートします。

水酸化ナトリウムとベータ-メルカプトエタノールが細胞を溶解し、ヒストンを含む細胞内タンパク質を放出します。

ライセートを遠心分離してタンパク質を収集します。上清を捨てます。

タンパク質ペレットにローディング色素を加え、加熱して変性させます。

これらの変性タンパク質とタンパク質マーカーをゲルにロードし、電気泳動してサイズ別に分離します。

タンパク質をメンブレン上に電気転写し、洗浄し、ブロッキングバッファーを添加して、非特異的結合を防ぎます。

修飾ヒストンに特異的に結合する一次抗体を追加します。

洗浄して結合していない抗体を除去し、一次抗体に結合する蛍光二次抗体とインキュベートします。

明確な蛍光バンドはヒストン修飾を確認し、神経変性タンパク質の過剰発現を示しています。

ウェスタンブロット分析のために細胞を溶解するには、酵母細胞ペレットを氷上で解凍してから、100マイクロリットルの蒸留水に再懸濁します。300マイクロリットルの0.2モル水酸化ナトリウムと20マイクロリットルの2-メルカプトエタノールを各細胞サンプルに加えます。そして、ピペッティングによってペレットを再懸濁します。

氷上で10分間インキュベートした後、遠心分離によって細胞をペレット化し、サンプルを100マイクロリットルのローディング色素に再懸濁します。次に、サンプルを加熱ブロックで10分間沸騰させます。サンプルを溶解している間に、2つのゲルをゲルホルダーに入れ、内側のチャンバーを上部までランニングバッファーで満たし、外側のチャンバーを2ゲルのラインマークまで満たします。

サンプルの準備ができたら、10ウェル12%ポリアクリルアミドゲルの各ウェルに各細胞溶解液15マイクロリットルをロードし、タンパク質ラダーレーンウェルに5マイクロリットルのタンパク質ラダーを加えます。ゲルを150ボルトで約45分間、またはロード色素の前面がゲルの底に達するまで実行します。

ゲルの実行中に、ゲルあたり2つのファイバーパッドを転写バッファーに浸し、ゲルあたり1つのポリフッ化ビニリデンまたはPVDFメンブレンをメタノールに浸します。ゲルの準備ができたら、メンブレンをすすぎ、バッファーを転写します。そして、半乾式転写装置セルの底に1つの事前に浸したファイバーパッドを置き、続いてPVDFメンブレン、ゲル、および2番目の事前に浸したファイバーパッドを置きます。

次に、電力を150ミリアンペアに1時間設定します。タンパク質転写の最後に、転写装置から膜を取り外し、蒸留水で短時間すすぎます。すす