ELISAを用いた神経変性疾患関連タンパク質α-シヌクレインの検出

変性疾患に関連する誤って折りたたまれたニューロンタンパク質である変異したα-シヌクレインを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳組織を高塩緩衝液に浸漬することから始めます。

大きな乳棒で組織を均質化し、続いて小さな乳棒で組織を破壊し、α-シヌクレインを含む細胞内タンパク質を放出します。

ホモジネートをチューブに移し、遠心分離します。タンパク質含有上清を回収し、緩衝液で希釈します。

この上清を、非特異的結合を防ぐためにブロッキング剤で前処理したαシヌクレイン特異的抗体でコーティングされたマイクロプレートに加えます。

攪拌しながらインキュベートし、正常および変異したα-シヌクレインが結合できるようにします。

プレートを洗浄し、変異したα-シヌクレインに特異的な検出抗体を加え、攪拌しながらインキュベートします。

再度洗浄し、酵素結合抗体を加え、撹拌下でインキュベートします。

基質を加え、暗所で撹拌しながらインキュベートします。基質は酵素と反応して色の変化を引き起こします。

酸との反応を停止し、吸光度を測定して、変異したα-シヌクレインを定量します。

脳ホモジネートを調製するには、以下の表に示すように、解剖された脳領域に適切な量のHSバッファーを加えて、予想されるホモジネートの割合に達します。ホウケイ酸ガラス管と2つの乳棒AとBで構成されたティッシュグラインダーを使用して、粉砕する脳領域をチューブに注ぎます。次に、乳棒Aで組織を10回均質化して解離させます。

次に、乳棒Bに切り替えて、さらに20回均質化します。トランスファーピペットを使用して、ホモジネートを1.5ミリリットルのチューブに移し、残りの脳サンプルでホモジナイゼーションを繰り返します。サンプルを摂氏4度で1,000gで5分間遠心分離します。そして、上清を集めて200マイクロリットルのアリコートに分けます。

100マイクロリットルの抗体コーティング溶液で、96ウェルマイクロプレートのウェルをコーティングし、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、300マイクロリットルのPBSTをウェルに加え、プレートウォッシャーを使用してプレートを5回洗浄します。室温で作業しながら、先に進み、200マイクロリットルのT20 PBSブロッキングバッファーを各ウェルに加え、プレートを150 RPMで1時間振とうてから、PBSTを使用してプレートを5回洗浄します。

BSAの1%であるPBSTを使用して、ここにリストされているガイドラインを使用して脳ホモジネートを希釈します。そして、各ウェルに100マイクロリットルを追加します。次に、室温および150 RPMで2時間インキュベートしてから、PBSTを使用してプレートを5回洗浄します。

最終洗浄後、テキストプロトコルの表2にリストされているように、PBSTおよび1%BSAで希釈した必要なアルファシヌクレイン検出抗体を加えます。室温、150 RPMで1時間インキュベートしてから、プレートを以前と同じように5回洗浄します。

次に、PBST、1%BSAで1〜8,000に希釈した抗マウスまたは抗ウサギIGG HRP複合体のいずれかを追加します。プレートを5回洗浄する前に、150 RPMで1時間インキュベートします。次に、各ウェルに100マイクロリットルのTMB溶液を加え、暗所で150 RPMで15分間インキュベートします。ウェルごとに1つの通常の塩酸100マイクロリットルを加えて反応を停止します。次に、マイクロプレートリーダーを使用して、450ナノメートルでの吸光度を測定します。