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死後のヒト脳組織から単離されたニューロメラニン顆粒(NMG)に由来するペプチドから始めます。
ドーパミン産生ニューロンに見られるNMGには、ニューロメラニン色素、タンパク質、脂質が含まれています。
疎水性リガンドで官能基化されたシリカベースの固定相を含む高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムを取ります。
ペプチドをカラムにロードします。
疎水性ペプチドは、親水性ペプチドよりもカラムに強く結合します。
溶出バッファーをカラムに通します。
疎水性の低いペプチドは最初に溶出し、疎水性のペプチドは後で溶出します。
溶出したペプチドは質量分析計のエレクトロスプレーイオン化源に入り、そこで荷電ペプチドイオンにイオン化されます。
イオン化されたペプチドは質量分析装置に入り、質量電荷比に基づいて分離されます。
選択されたペプチドイオンをコリジョンセルに向け、より小さなイオンに断片化し、その質量電荷比を再度測定します。
最後に、データを参照データベースと比較して、NMG サンプル中に存在するタンパク質を特定します。
本文で説明されているように、トリプシン消化を実行した後、不活性質量分析ガラスバイアル入口に200〜400ナノグラムのサンプルペプチドを定義容量の0.1%TFAに溶解して、HPLC-MS分析用のサンプルを調製します。サンプル量が少ないために濃度測定が適用できない場合は、総イオン電流を比較して、同一のサンプル負荷を確認します。
プロテオミクス生データ解析を開始するには、[ロード]をクリックしてRAWファイルをソフトウェアにロードします。[実験の設定]をクリックして、サンプル名を割り当てます。グループ固有のパラメーターを定義するには、可変修飾として脱アミド化 NQ、酸化 M、およびカルバミノメチル化 N-Term を選択して修飾を追加します。そして、固定修飾としてカルバミノメチル化Cを加えます。消化タブで消化酵素としてトリプシンを選択します。
ラベルフリーの「定量化」タブで、オプション LFQ を追加します。また、10 個を超えるファイルを処理する場合は、高速 LFQ オプションを選択して処理時間を短縮します。他のすべてのグループ固有のパラメータが工場出荷時の設定のままであることを確認して、[グローバルパラメータ]タブに進み、[シーケンス]タブの uniprot.org から派生したFASTAファイルを追加します。それに応じて識別子ルールを変更し、ホモ・サピエンスの分類 ID 9606 を追加します。
タンパク質の定量には、独自のカミソリペプチドを選択します。次に、ラベルフリーの定量タブにタンパク質定量の尺度としてiBAQオプションを追加します。他のすべてのグローバルパラメータが工場出荷時の設定のままであることを確認し、[開始]をクリックします。分析が正常に実行されたら、タンパク質グループの.txt出力を取得します。