小児神経膠腫細胞遊走を可視化するための免疫細胞化学ベースのイメージング

腫瘍微小環境のマトリックスを模倣する細胞外ポリマーと接着タンパク質を含む基底膜マトリックスでコーティングされた平底マルチウェルプレートから始めます。

小児脳腫瘍に由来する神経膠腫細胞の神経球を含む培地を導入し、それがウェルの中央に配置されるようにします。

マトリックスは、ウェルへの神経球の付着を促進します。

バックグラウンドサプレッサー試薬を追加して、非特異的蛍光を最小限に抑えます。

次に、緑色の蛍光色素結合抗CD44抗体を導入します。

プレートを、細胞の生理学的状態を維持するインキュベーター内に収容された生細胞イメージングシステムに移します。

時間の経過とともに、神経膠腫細胞は接着タンパク質と相互作用する細胞接着タンパク質CD44を発現します。

これにより、細胞シグナル伝達経路が活性化され、神経球からの細胞移動が促進されます。

蛍光色素結合抗CD44抗体は、神経膠腫細胞上で発現したCD44に結合し、蛍光を発します。

緑色の蛍光細胞が神経球から遠ざかる様子は、神経膠腫細胞の移動を裏付けています。

ウェルを BMM でコーティングしたら、P200 チップをカットします。選択した各ウェルから50マイクロリットルの細胞培地とNSを取り、コーティングされた平らな底ウェルに移します。各ウェル内のNSの存在と位置を目視で確認します。希釈したBSRおよびALR抗体50マイクロリットルを各ウェルにそっと加え、試薬が混合するまで2〜3分間待ちます。また、倒立顕微鏡を使用して、複製されたNSのほとんどがウェルの中央に配置されていることを確認します。気泡がないことを確認した後、前述のようにプレートを生細胞分析装置にそっと移します。

生細胞分析装置ソフトウェアで、オプション「Schedule To Acquire」を選択します。次に、プラスタブをクリックし、スケジュールに従ってスキャンを選択して、テキスト原稿に記載されている間隔でプレートをスキャンします。ソフトウェアウィンドウで、船舶を作成または復元し、オプションをクリックします 新規.移行アッセイには、希釈クローニングスキャンタイプ、4倍対物レンズ、フェーズとグリーンを選択します。プレートタイプを選択し、プレートマップ上でウェルを強調表示してスキャンするウェルを定義します。次に、スキャン周波数を設定します。[スケジュールに追加]をクリックして、スキャンを開始します。