免疫蛍光法を用いた小腸神経内分泌腫瘍スフェロイドの特性評価

小腸神経内分泌腫瘍スフェロイドをチューブに入れます。

細胞を保存するために固定液を追加します。

固定液を洗浄し、遠心分離し、緩衝液と交換します。

遠心分離して上清を廃棄し、残っている固定液を除去します。

細胞膜を透過処理し、非特異的抗体結合を防ぐために、界面活性剤とブロッキング剤を含むバッファーを追加します。

余分な洗剤とブロッキング剤を取り除くためにバッファーで洗浄します。

神経内分泌細胞に特異的な標的タンパク質に結合する一次抗体とインキュベートします。

バッファーで洗浄して、結合していない抗体を除去します。

一次抗体に結合する蛍光色素タグ付き二次抗体を追加します。

余分な抗体を除去するためにバッファーですすぎます。

核を染色するための色素を含む封入剤を追加します。

回転楕円体をスライドに移し、カバースリップで取り付けます。

蛍光顕微鏡を使用して、特定のタンパク質を発現するスフェロイドの神経内分泌細胞を視覚化します。

500マイクロリットルのパラホルムアルデヒドを加え、15分間インキュベートしてオルガノイドを固定します。インキュベーション後、培養物を1ミリリットルのPBSで2回洗浄します。500マイクロリットルのPBSに3%BSAおよび0.1%Triton X-100を加えて、培養物を透過処理します。チューブを5分間インキュベートし、オルガノイドを1ミリリットルのPBSと3%BSAで3回洗浄します。

次に、培養物を一次抗体とともに1時間インキュベートし、PBSとBSAで洗浄を繰り返します。二次抗体とインキュベートし、洗浄を繰り返し、すべての上清を吸引して廃棄します。

スフェロイドを画像化するには、DAPIを含む5マイクロリットルの封入剤を追加し、P20ピペットを使用して5マイクロリットルのスフェロイドをスライドガラスに移します。スライドをカバースリップで密封し、10倍、20倍、40倍の対物レンズを使用して蛍光顕微鏡で画像化します。