急性マウス脳切片における酸素消費率の測定

健康な神経変性マウスの脳スライスパンチをサンプル保持スクリーンに置きます。

スクリーンを裏返してティッシュプレートに挿入します。

センサープローブ付きの事前に校正されたセンサーカートリッジを取ります。化合物(ピルビン酸、オリゴマイシン、FCCP、アンチマイシンA)を注入ポートにロードします。

カートリッジをティッシュプレートに置きます。細胞外フラックス分析装置で実行を開始します。

プローブは、スライスの酸素消費率(OCR)を測定します。

最初の注射で、ピルビン酸がミトコンドリアに入り、電子担体を生成します。

これらの担体は、電子伝達系または(ETC)の錯体IおよびIIに電子を供与し、酸素消費量とOCRを増加させる電子移動反応を開始します。

オリゴマイシンは複合体Vを阻害し、ATP合成を停止させ、OCRを低下させます。

プロトノフォアであるFCCPは、プロトン勾配を乱し、酸素消費量とOCRを増加させます。

抗マイシンAは複合体IIIに結合してETCを停止し、OCRを最小限に抑えます。

OCR プロファイルを比較します。

神経変性スライスのOCRの低下は、ミトコンドリア障害を示しています。

パン

チされた脳組織を1枚吸引し、組織をキャプチャ画面のメッシュ側に慎重に置きます。片側にメッシュが取り付けられた円形のプラスチック片。紙ティッシュを使用して、キャプチャ スクリーンを優しく乾かし、水分を取り除くと、ティッシュがベタベタしてメッシュの中心に付着します。

次に、キャプチャ画面を持ち、ピンセットでスライス面を下にして、インキュベーション膵島プレートのウェルの1つに入れます。次に、膵島プレートをインキュベーター内で摂氏37度で少なくとも30分間インキュベートし、アッセイを実行する前に温度とpHの平衡化を可能にします。目的の化合物とBSAを含まない修飾人工脳脊髄液を、それぞれポートAからDの作業濃度の最終ストック濃度に希釈します。

完全に挿入すると、ポートから化合物が漏れる可能性があるため、チップを注入ポートの壁に当てて、チップを注入ポートの半分に45度の角度で置き、75マイクロリットルの希釈した化合物をセンサーカートリッジの適切な注入ポートにそっと予装します。その後、気泡を発生させないようにチップをポートから慎重に引き抜き、気泡を軽減しないようにカートリッジのどの部分も軽くたたかないでください。次に、注入ポートが均一に装填されているかどうかを目視検査し、すべての液体がポート内にあり、カートリッジの上部に残留液滴がないことを確認します。

センサーカートリッジをユーティリティプレートに置いた後、インキュベーターに30分間入れて37°Cまで加熱し、ユーティリティプレートだけをつかみ、できるだけ動かさないように慎重に取り扱います。まず、ソフトウェアにアッセイテンプレートをロードし、緑色のスタートボタンを