ウェスタンブロッティングによるリン酸化ニューロン塩化カリウム共輸送体2の検出

ニューロンの塩化物レベルを調節するカリウム-塩化物共輸送体 2、または KCC2 タンパク質を含む細胞ライセートを取ります。

調節部位でのリン酸化はKCC2機能を破壊し、ニューロンの活動を調節します。

リン酸化KCC2を標的とする抗体と結合したビーズにライセートを加えます。インキュベートして結合させ、洗浄して結合していないタンパク質や細胞破片を除去します。

高温で変性バッファーで処理してKCC2を放出し、遠心分離してビーズを分離します。

KCC2含有上清を電気泳動ゲルにロードします。タンパク質をバンドに分離して、リン酸化KCC2の存在を確認します。

バンドをメンブレンに移し、ブロッキング溶液でインキュベートして非特異的結合部位をマスクします。

リン酸化KCC2を標的とする一次抗体とインキュベートします。

洗浄し、酵素タグ付き二次抗体とインキュベートして一次抗体を標識します。

もう一度洗浄し、化学発光基質を加えると、酵素と反応して光が発生します。

光強度を測定して、ライセート中のリン酸化KCC2を定量します。

300マイクロリットルのプロテインGセファロースを微量遠心チューブにピペットで入れます。次に、溶液を500 Gで2分間遠心分離します。上清を廃棄した後、500マイクロリットルのPBSを加え、よくボルテックスします。遠心分離後に上清を廃棄し、このステップを繰り返します。

次に、1ミリグラムの抗KCC2スレオニン906および抗KCC2スレオニン1007抗体を200マイクロリットルのプロテインGセファロースビーズと混合してから、PBSで500マイクロリットルに容量を作ります。振動台または回転ホイールで摂氏4度で2時間振とうした後、PBSで2回の洗浄を繰り返します。

細胞溶解物に対してタンパク質定量化を実行し、洗浄したビーズに1ミリグラムの細胞溶解物を加え、エンドツーエンドの回転子でインキュベートしてからスピンダウンします。150ミリモルの塩化ナトリウムを含むPBSで3回洗浄し、続いて200マイクロリットルのPBSで3回洗浄してから、最終ペレットを100マイクロリットルのLDSサンプルバッファーに再懸濁します。

ローターシェーカーでチューブを室温で5分間振とうします。それらを加熱ブロックでインキュベートし、ゲルローディングに上清を使用する前に遠心分離します。ウェスタンブロットキャスティング装置を組み立て、新しく調製した8%分離ゲルを注ぎ、キャスティングガラスの上部から約2センチメートルのスペースを確保してゲルをキャストします。セットアップに200マイクロリットルの無水イソプロパノールを加え、室温で60分間放置します。

ピペットを使用してイソプロパノールを取り出し、約200マイクロリットルの蒸留水でゲルを注意深くすすいでください。調製したばかりの6%スタッキングゲルを鋳造セットアップに加えた後、ウェルコームにそっとフィットさせ、室温で30分間放置します。次に、キャストしたゲルを電気泳動タンクに固定します。

ランニングバッファーをタンクに注いだ後、5マイクロリットルの分子量マーカーを最初のウェルにロードし、同量のタンパク質をSDS-PAGEゲルの各ウェルにロードします。空のウェルをLDSで満たし、120ボルトで約90〜120分間ゲルを実行します。ニトロセルロース膜を20%メタノールを含む転写バッファーで再水和します。

ゲルとメンブレンを転写バッファーですすぎ、準備スタックにそっと広げます。転写するサンドイッチを、負極、サンドイッチフォーム、ろ紙、すすぎSDS-PAGEゲル、すすぎニトロセルロース膜、ろ紙、サンドイッチフォーム、正極の順に並べます。完了したら、組み立てたサンドイッチを移送タンクに積み重ね、90ボルトで90分間、または30ボルトで360分間運転します。

ブロッキングバッファーを使用して、室温で乾燥膜を1時間ブロックします。一次抗体とベータアクチンの適切な希釈液をブロッキングバッファーで室温で1時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、TBSTを5分間3回洗浄します。

洗浄したメンブレンをブロッキングバッファーで希釈した二次抗体とともに60分間インキュベートし、TBSTの洗浄を3回繰り返します。完了したら、洗浄したメンブレンをイメージングボードに置きます。シグナルを発生させるには、各増強化学発光試薬を等量混合して調製した溶液をメンブレン上に広げてから、イメージングボードをイメージングシステムに移してイメージングします。