ウェスタンブロッティングによるリン酸化ニューロン塩化カリウム共輸送体2の検出

ニューロンの塩化物レベルを調節するカリウム-塩化物共輸送体 2、または KCC2 タンパク質を含む細胞ライセートを取ります。

調節部位でのリン酸化はKCC2機能を破壊し、ニューロンの活動を調節します。

リン酸化KCC2を標的とする抗体と結合したビーズにライセートを加えます。インキュベートして結合させ、洗浄して結合していないタンパク質や細胞破片を除去します。

高温で変性バッファーで処理してKCC2を放出し、遠心分離してビーズを分離します。

KCC2含有上清を電気泳動ゲルにロードします。タンパク質をバンドに分離して、リン酸化KCC2の存在を確認します。

バンドをメンブレンに移し、ブロッキング溶液でインキュベートして非特異的結合部位をマスクします。

リン酸化KCC2を標的とする一次抗体とインキュベートします。

洗浄し、酵素タグ付き二次抗体とインキュベートして一次抗体を標識します。

もう一度洗浄し、化学発光基質を加えると、酵素と反応して光が発生します。

光強度を測定して、ライセート中のリン酸化KCC2を定量します。

300マイクロリットルのプロテインGセファロースを微量遠心チューブにピペットで入れます。次に、溶液を500 Gで2分間遠心分離します。上清を廃棄した後、500マイクロリットルのPBSを加え、よくボルテックスします。遠心分離後に上清を廃棄し、このステップを繰り返します。

次に、1ミリグラムの抗KCC2スレオニン906および抗KCC2スレオニン1007抗体を200マイクロリットルのプロテインGセファロースビーズと混合してから、PBSで500マイクロリットルに容量を作ります。振動台または回転ホイールで摂氏4度で2時間振とうした後、PBSで2回の洗浄を繰り返します。

細胞溶解物に対してタンパク質定量化を実行し、洗浄したビーズに1ミリグラムの細胞溶解物を加え、エンドツーエンドの回転子でインキュベートしてからスピンダウンします。150ミリモルの塩化ナトリウムを含むPBSで3回洗浄し、続いて200マイクロリットルのPBSで3回洗浄してから、最終ペレットを100マイクロリットルのLDSサンプルバッファーに再懸濁します。

ローターシェーカーでチューブを室温で5分間振とうします。それらを加熱ブロックでインキュベートし、ゲルローディングに上清を使用する前に遠心分離します。ウェスタンブロットキャスティング装置を組み立て、新しく調製した8%分離ゲルを注ぎ、キャスティングガラスの上部から約2センチメートルのスペースを確保してゲルをキャストします。セットアップに200マイクロリットルの無水イソプロパノールを加え、室温で60分間放置します。

ピペットを使用してイソプロパノールを取り出し、約200マイクロリットルの蒸留水でゲルを注意深くすすいでください。調製したばかりの6%スタッキングゲルを鋳造セットアップに加え