JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 3:06 分 • April 28th, 2025
ネズミの目から分離した化学的に固定された網膜を取ります。
目は、角膜を取り巻く血管のネットワークである輪部血管叢に熱誘発性の損傷を示します。
この損傷は体液の排出を妨げ、眼圧(IOP)を上昇させ、網膜神経節細胞(RGC)の変性を引き起こします。
網膜を透過処理溶液で処理して、細胞膜と核膜を透過処理します。
非特異的抗体結合を防ぐためにブロッキング溶液を塗布します。
ブロックソリューションを削除します。
RGCで主に発現する転写因子を標的とする一次抗体を導入します。
洗浄して、結合していない抗体を除去します。
一次抗体に結合する蛍光色素結合二次抗体を導入します。
洗浄して、結合していない抗体を除去します。
DNA結合色素で核を対比染色します。
網膜を洗浄し、適切な封入剤を使用してスライドガラスに取り付けます。
落射蛍光顕微鏡で網膜を視覚化します。
対照と比較して損傷した眼の細胞密度が低下すると、眼圧の増加によるRGC変性が確認されます。
網膜を単離した後、網膜の内側を上に向けて、1ミリリットルPBSを含む24ウェル培養プレートに網膜を移します。PBSで希釈した0.5%非イオン性界面活性剤で洗浄することにより、組織を透過処理します。次に、組織をブロッキング溶液中で室温で1時間インキュベートし、穏やかに振とうします。インキュベーション中に、BRM 3A一次抗体溶液を調製し、摂氏4度で保存します。
組織ブロッキング後、網膜を摂氏4度の200マイクロリットルの一次抗体溶液中で72時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。次に、組織をPBSで洗浄します。組織を200マイクロリットルの二次抗体溶液で室温で2時間インキュベートし、次に核対比染色液と10分間インキュベートして蛍光核染色を行います。
PBSを3回洗浄した後、硝子体面を上にしたまま、2本の小さなブラシを使用して網膜をガラス顕微鏡スライドに移します。背側網膜象限を顕微鏡スライドの上に配置します。最後に、200マイクロリットルの色あせ防止封入剤をガラスカバーガラスに塗布し、平らに取り付けられた網膜に置いて顕微鏡分析を行います。40倍の対物レンズを使用した共焦点落射蛍光顕微鏡下で、フラットマウントを調べて網膜神経節細胞を推定します。