JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 7:03 分 • April 28th, 2025
神経球細胞を界面活性剤、カルシウム、プロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液に取ります。
界面活性剤は細胞を透過性化し、阻害剤はプロテアーゼを不活性化してクロマチン結合標的タンパク質を保存します。
ヌクレアーゼを加えてインキュベートします。ヌクレアーゼはカルシウムを使用してクロマチンを消化します。
カルシウムをキレート化してヌクレアーゼを不活性化するEDTA含有バッファーを追加します。
溶解バッファーを加えて細胞を溶解し、クロマチンを放出します。
遠心分離して上清を回収します。
標的タンパク質に特異的な抗体を加え、ローテーションしながらインキュベートします。遠心分離して上清を除去します。
抗体を標的とする磁気ビーズを導入し、回転しながらインキュベートします。
非特異的に結合したDNAを分離するために溶解バッファーを追加します。
ビーズを磁気的に捕捉し、上清を除去します。
高塩バッファーを加えて、非特異的に結合したタンパク質を分離します。
ビーズを磁気的に捕捉し、上清を除去します。
安定化バッファーを加え、ビーズを磁気的に捕捉し、汚染物質を除去します。
プロテイナーゼ-Kバッファーに再懸濁してタンパク質を消化し、DNAを放出します。
神経球が採取されたら、免疫沈降ごとに10倍の6つの神経球細胞を300回gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清をデカントし、神経球ペレットを1ミリリットルのバランス塩溶液に再懸濁します。懸濁液を低タンパク質結合1.5ミリリットル微量遠心チューブに移し、前と同じように遠心分離します。
次に、上清をデカントし、細胞ペレットを1〜100にプロテアーゼ阻害剤カクテルを1回10〜6細胞に添加した95マイクロリットルの消化バッファーに再懸濁します。凝集を防ぎ、気泡の発生を避けるために、すぐに細胞を上下にピペットで移動します。次に、5マイクロリットルの0.1xミクロコッカスヌクレアーゼと145マイクロリットルの消化バッファーを混合し、1×10あたり5マイクロリットルの希釈ミクロコッカスヌクレアーゼを6細胞に加えます。チューブをフリックして混合し、チューブを摂氏37度のヒートブロックに正確に12分間置きます。
クロマチンを断片化するためのミクロコッカスヌクレアーゼ消化は、最も重要なステップです。適切なクロマチン断片化は、ChIPの高分解能を達成するために重要です。このステップを確実に成功させるには、複数のサンプルを一度に1つずつインキュベートして、過剰消化が発生しないようにします。
12分後、10×10ごとに10マイクロリットルの10xミクロコッカスヌクレアーゼ停止バッファーを6つの細胞に加えます。この時点以降、サンプルは氷上に保管する必要があります。ミクロコッカスヌクレアーゼ消化サンプルのバイオアナライザー分析により、DNAのほとんどがモノヌクレオソーム、ジヌクレオソーム、トリヌクレオソームに断片化されていることが示されました。次に、プロテアーゼ阻害剤カクテルを1〜100で添加した110マイクロリットルの2x RIPAバッファーを1回10ごとに6細胞に加えます。
チューブをフリックして混合し、摂氏4度、gの1,700倍で15分間遠心分離します。クロマチンを含む上清を通常の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、氷の上に置きます。プロテアーゼ阻害剤を1〜1,000で添加したRIPAバッファーを使用してクロマチンを希釈し、各IPの体積が100〜200マイクロリットルになるようにします。次に、入力サンプルとしてChIP容量の10%に相当するアリコートを取り除きます。
プロテイナーゼ-Kを添加した100マイクロリットルのTEバッファーを加えてインプットを調製し、摂氏55度で1時間インキュベートします。PCR精製キットでインプットを精製した後、マイクロボリューム分光光度計を使用してインプットの濃度を測定します。結果をノートブックに記録します。各サンプルに対して実行されるIPあたり10マイクロリットルの洗浄されたプロテインAおよびG磁気ビーズを追加し、摂氏4度で20RPMで回転させながら1時間インキュベートします。
サンプルを磁気ホルダーに置き、ビーズを分離させます。次に、必要な量を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。目的の抗体を各チューブに追加し、蒸発を防ぐためにキャップをプラスチックパラフィンフィルムで包みます。サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートし、以前と同様にローテーションします。翌日、チューブを2000回gで10秒間回転させます。次に、各IPに10マイクロリットルのビーズを加え、摂氏4度で20RPMで回転させながら3時間インキュベートします。
次に、サンプルを磁気スタンドに置き、磁気ビーズを分離させます。ピペットを使用して上清を取り除きます。次に、プロテアーゼ阻害剤を含む150マイクロリットルのRIPAバッファーを各IPに加え、摂氏4度、20 RPMで5分間インキュベートします。インキュベーション期間が経過した後、サンプルを磁気スタンドに置き、磁気ビーズを分離させます。ピペットを使用して上清を取り除きます。次に、低濃度のプロテアーゼ阻害剤を添加した150マイクロリットルの塩化リチウム緩衝液を各IPに加え、摂氏4度で20 RPMで回転させながら5分間インキュベートします。
インキュベーション期間が経過したら、サンプルを磁気スタンドに置き、磁気ビーズを分離させます。次に、ピペットを使用して上清を除去します。次に、プロテアーゼ阻害剤を含まない150マイクロリットルの低温TEをビーズに加え、摂氏4度で20RPMで回転させながら5分間インキュベートします。最終洗浄ステップの後、最終濃度0.5ミリグラム/ミリリットルのプロテイナーゼ-Kを添加した100マイクロリットルのTEバッファーにサンプルを再懸濁し、摂氏55度で1時間インキュベートします。