ニューロスフェア細胞のネイティブクロマチン免疫沈降

神経球細胞を界面活性剤、カルシウム、プロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液に取ります。

界面活性剤は細胞を透過性化し、阻害剤はプロテアーゼを不活性化してクロマチン結合標的タンパク質を保存します。

ヌクレアーゼを加えてインキュベートします。ヌクレアーゼはカルシウムを使用してクロマチンを消化します。

カルシウムをキレート化してヌクレアーゼを不活性化するEDTA含有バッファーを追加します。

溶解バッファーを加えて細胞を溶解し、クロマチンを放出します。

遠

心分離して上清を回収します。

標的タンパク質に特異的な抗体を加え、ローテーションしながらインキュベートします。遠心分離して上清を除去します。

抗体を標的とする磁気ビーズを導入し、回転しながらインキュベートします。

非特異的に結合したDNAを分離するために溶解バッファーを追加します。

ビーズを磁気的に捕捉し、上清を除去します。

高塩バッファーを加えて、非特異的に結合したタンパク質を分離します。

ビーズを磁気的に捕捉し、上清を除去します。

安定化バッファーを加え、ビーズを磁気的に捕捉し、汚染物質を除去します。

プロテイナーゼ-Kバッファーに再懸濁してタンパク質を消化し、DNAを放出します。

神経球が採取されたら、免疫沈降ごとに10倍の6つの神経球細胞を300回gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清をデカントし、神経球ペレットを1ミリリットルのバランス塩溶液に再懸濁します。懸濁液を低タンパク質結合1.5ミリリットル微量遠心チューブに移し、前と同じように遠心分離します。

次に、上清をデカントし、細胞ペレットを1〜100にプロテアーゼ阻害剤カクテルを1回10〜6細胞に添加した95マイクロリットルの消化バッファーに再懸濁します。凝集を防ぎ、気泡の発生を避けるために、すぐに細胞を上下にピペットで移動します。次に、5マイクロリットルの0.1xミクロコッカスヌクレアーゼと145マイクロリットルの消化バッファーを混合し、1×10あたり5マイクロリットルの希釈ミクロコッカスヌクレアーゼを6細胞に加えます。チューブをフリックして混合し、チューブを摂氏37度のヒートブロックに正確に12分間置きます。

クロマチンを断片化するためのミクロコッカスヌクレアーゼ消化は、最も重要なステップです。適切なクロマチン断片化は、ChIPの高分解能を達成するために重要です。このステップを確実に成功させるには、複数のサンプルを一度に1つずつインキュベートして、過剰消化が発生しないようにします。

12分後、10×10ごとに10マイクロリットルの10xミクロコッカスヌクレアーゼ停止バッファーを6つの細胞に加えます。この時点以降、サンプルは氷上に保管する必要があります。ミクロコッカスヌクレアーゼ消化サンプルのバイオアナライザー分析により、DNAのほとんどがモノヌクレオソーム、ジヌクレオソーム、トリヌクレ