FlexStation 3を用いてTRPチャネルの機能のハイスループットスクリーニングへの媒体のためのセルベースカルシウムアッセイ

この手順の全体的な目標は、Flex Station 3 を使用して、一過性受容体電位の薬理学的プロファイルを研究するか、1 つのチャネルをトリップするアプリケーションを実証することです。これは、まず、96で1チャネルのトリップを発現する細胞を調製することによって達成される。マイクロタイタープレートも充実しています。

マイクロプレートウォッシャーで細胞を洗浄した後、細胞にカルシウム感受性蛍光色素を充填します。インフルエンザ oh 4:00 AM 細胞のローディング期間の後、さらに数回の洗浄が行われます。手順の次のステップは、トリップ、1つのアゴニスト、および推定トリップ、1つのアンタゴニストを含むコンパウンドプレートを準備することです。

最後のステップとして、Flex Station threeシステムでプレートを読み取るためのソフトウェアパラメータを設定します。最終的には、トリップAに対する用量反応関係を示す結果を得ることができ、インフルエンザ音素酸による1回の活性化、および拮抗薬化合物Aによる阻害を示すことができるが、この方法は、カルシウムの流入を測定することにより、21の活性化メカニズムについての洞察を提供することができる。また、カルシウム感受性凍結色素またはマリー電位色素を使用して、他のカルシウム透過性眼チャネルおよび深部タンパク質共役受容体の機能の研究にも適用できます。

カルシウムイメージングや手動パッチマッピングなどの既存の方法に対するこの戦術の主な利点は、この時間節約技術により、カルシウムフォーミュラ、鉄チャネル、およびその他のCA動員受容体の機能と調節のためのハイスループットスクリーニングを提供できることです。このプロトコルの開始に先立って、トリップA1で安定的にトランスフェクトされたHEC 2 93細胞を、書かれたプロトコルに記載されているように70〜90%の密度に増殖させる。カルシウムアッセイ用の細胞調製を開始するには、50マイクロリットルのポリLオルニチンを各ウェルにピペッティングして96ウェルプレートをコーティングし、プレートを摂氏37度で少なくとも15分間インキュベートします。

インキュベーション後、KOのリン酸緩衝生理食塩水で細胞を一度すすぎます トリプシンの後、HEC 2 93細胞は所望量の細胞を15ミリリットルの滅菌円錐形ボトムチューブに移し、遠心分離します。サンプル。上清を取り除き、得られた細胞ペレットを再懸濁します。

10%熱不活化ウシ胎児血清を添加したDMEM培養培地で、100マイクロリットルの細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに分注します。マルチチャンネルピペッターを使用して、プレートをフードに少なくとも30分間置いてから、加湿細胞培養インキュベーターに20〜44時間入れます。カルシウムアッセイの調製には、まず、書面によるプロトコルに記載されている溶液を調製します。

準備が完了したら、10マイクロリットルの1ミリモルインフルエンザoh 4:00 AMを10マイクロリットルのオン酸と混合します。F1 27、全内容物を5ミリリットルのインフルエンザに移します。Oh 4アッセイバッファーに0.1%ウシ血清アルブミンを添加。

次に、96で増殖した細胞を洗浄します。ウェルプレートをウェルあたり80マイクロリットルのHBSSでウェルプレートを2回、洗浄後にマイクロプレートウォッシャーを使用して、午前4時00分にウェルあたり50マイクロリットルのインフルエンザローディング溶液をマルチチャンネルピペッターで加え、プレートを摂氏37度で1時間インキュベートします。1時間の細胞ローディング期間中に、アゴニストの3つのx溶液、アンタゴニストの3つのx溶液のシリーズ、および大量の300マイクロモルアゴニストをflu oh four assayバッファーピペットで調製します。

300マイクロリットルの希釈化合物溶液を96ウェル化合物プレートに入れます。可能な限り、化合物の段階希釈と対応するポジティブコントロールとネガティブコントロールをコンパウンドプレートの同じカラムに配置するように手配します。Flex Station 3 は一度に 1 つのカラムを読み取るため、最終的な細胞調製ステップとして、アンタゴニストを含む各ウェルに隣接する 300 マイクロモルのアゴニスト溶液を 300 マイクロリットルピペットで取ります。

最後の洗浄後、マイクロプレートウォッシャーを使用して、ロードした細胞をflu oh four acid bufferで3回洗浄します。各ウェルに80マイクロリットルのインフルエンザoh four acidバッファーを残します。プレートの読み取りを開始するには、Flex Station threeシステムの電源を入れ、soft max Pro 5.2ソフトウェアを起動します。

セットアップ時に新しいファイル名で実験を保存します。フレックスモードを選択し、手順書に記載されているアゴニストとアンタゴニストの効果を測定するためのパラメータを入力します。次に、新しいチップボックス、コンパウンドプレート、およびリーディングプレートをフレックスステーションの適切なトレイに配置します。3。

プレートの読み取りを開始するには、Soft Max Proソフトウェアの読み取りボタンをクリックします。Flex Station 3は、一度に1つのカラムを読み取り、読み取りを中断することなく、事前にプログラムされた時点で化合物を追加します。実行が完了したら、実験データをSoft Max PROソフトウェアを使用して直接処理するか、Microsoft Excelなどのスプレッドシートプログラムにコピーして貼り付けることができます。

データを分析するために、トリップの濃度応答曲線、1つのアゴニストであるインフルエンザの音素酸、および推定トリップの1つのアンタゴニスト化合物を、書かれた手順トリップに記載されている最小二乗フィッティングを使用して生成します。一つはカルシウム透過性陽イオンチャネルの活性化がカルシウム流入をもたらし、これはカルシウム感受性染料インフルエンザoh 4:00 AMによって検出することができます。一連のインフルエンザ音素酸またはFFA濃度に応答して蛍光が変化するまでの時間経過の代表的な痕跡が、高濃度で示されています。FFA誘発蛍光は、同様のピーク蛍光レベルにもかかわらず、低濃度よりもはるかに速い速度論で増加します。

これらの違いを区別するために、蛍光増加の初期速度を測定することにより、濃度応答関係を構築しました。FFAの濃度を変化させると、FFAの半値最大有効濃度は55.4マイクロモルと決定されました。FFA誘発カルシウム応答の阻害の濃度応答関係は、1つのアンタゴニスト化合物Aが化合物であると推定トリップすることによっても示されている。

用量は独立して、トリップA細胞のFFAに対する応答を減少させ、4.3マイクロモルの半値最大阻害濃度を示しました。このビデオを見れば、フラッグステーション3を使用してトリプルAワンおよび関連チャネルの薬理学的プロファイルを研究する方法について十分に理解できるはずです。