FlexStation 3を用いてTRPチャネルの機能のハイスループットスクリーニングへの媒体のためのセルベースカルシウムアッセイ

この手順の全体的な目的は、Flex Station 3を用いて、一過性受容体電位（TRP）A1チャネルの薬理学的プロファイルを研究するためのアプリケーションを実演することです。これは、まずTRPA1チャネルを発現させた細胞を96ウェルマイクロタイタープレートに調製することによって達成されます。

マイクロプレートウォッシャーで細胞を洗浄した後、カルシウム感受性蛍光色素で細胞を負荷します。Fluo-4 AMで細胞を負荷した後、さらに数回の洗浄を行います。手順の次のステップは、TRPV1アゴニストおよび想定されるTRPV1アンタゴニストを含む化合物プレートを準備することです。

最終ステップとして、Flex Station threeシステムでのプレート読み取りに向けてソフトウェアパラメータを設定します。最終的に、フルフォネミック酸によるtrip A oneの活性化、およびアンタゴニスト化合物Aによる抑制に関する用量反応関係を示す結果を得ることができます。この手法は、カルシウム流入を測定することで21の活性化メカニズムへの知見を提供できるだけでなく、カルシウム感受性フルオロ染料や膜電位染料を用いて、他のカルシウム透過性イオンチャネルやGタンパク質共役受容体の機能を研究することにも適用可能です。

カルシウムイメージングや手動パッチマッピングなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、この時間短縮技術により、カルシウム処方、鉄チャネル、およびその他のカルシウム動員受容体の機能および調節に関するハイスループットスクリーニングが可能になることです。このプロトコルの開始前に、書面によるプロトコルに従い、trip A oneを安定的に導入したHEC 2 93細胞を密度70%から90%まで培養します。カルシウムアッセイのための細胞調製を開始するには、96ウェルプレートの各ウェルにpoly L ornithineを50 µLずつピペッティングしてコーティングし、プレートを37 °Cで少なくとも15分間インキュベートします。

インキュベーション後、細胞をKOのリン酸緩衝生理食塩水で1回洗浄します。トリプシン処理後、HEC 2 93細胞の必要量を15 mLの滅菌コニカルチューブに移し、サンプルを遠心分離します。上清を除去し、得られた細胞ペレットを再懸濁します。

10%の熱不活化ウシ胎児血清を添加したDMEM培地を用い、96ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液を100 µLずつ分注します。マルチチャンネルピペットを使用し、プレートをフード内に少なくとも30分間静置した後、加湿細胞培養インキュベーターに20〜44時間置いてください。カルシウムアッセイの準備として、まず書面プロトコルに記載されている通りに溶液を調製します。

準備が完了したら、1 mMのflu oh 4:00 AM 10 µLをonic. F1 27 10 µLと混合し、全量を0.1%牛血清アルブミンを添加した5 mLのflu. Oh fourアッセイバッファーに移します。

次に、96ウェルプレートで培養した細胞を、マイクロプレートウォッシャーを用いてHBSSで1ウェルあたり80 µLで2回洗浄します。洗浄後、マルチチャンネルピペットを用いてFluo-4 AMローディング溶液を1ウェルあたり50 µL添加し、プレートを37 °Cで1時間インキュベートします。この1時間の細胞ローディング時間中に、アゴニストの3倍濃度溶液シリーズ、アンタゴニストの3倍濃度溶液シリーズ、およびFluo-4アッセイバッファーに溶解した300 µMのアゴニストを十分な量準備します。

希釈した化合物溶液300 µLを96ウェル化合物プレートに分注します。可能な限り、化合物の連続希釈系列と、それに対応する陽性および陰性コントロールを、化合物プレートの同じ列に配置するようにしてください。Flex stationは一度に1列ずつ読み取ります。そのため、最終的な細胞調製ステップとして、アンタゴニストを含む各ウェルの隣に、300 µMのアゴニスト溶液300 µLをピペットで分注してください。

マイクロプレートウォッシャーを用いて、播種した細胞をflu oh four酸緩衝液で3回洗浄し、最後の洗浄後に各ウェルに80 µLのflu oh four酸緩衝液を残します。プレートの読み取りを開始するには、Flex Station threeシステムを起動し、soft max Pro 5.2ソフトウェアを立ち上げます。

セットアップ時に、新しいファイル名で実験を保存します。フレックスモードを選択し、記述された手順に従ってアゴニストおよびアンタゴニスト効果を測定するためのパラメータを入力します。次に、新しいチップボックス、化合物プレート、および測定プレートをフレックスステーションの適切なトレイに配置します。3。

Soft Max Proソフトウェアのリードボタンをクリックして、プレートの読み取りを開始します。Flex Station threeは、読み取りを中断することなく、1列ずつ読み取りを行いながら、あらかじめプログラムされたタイムポイントで化合物を添加します。ランが完了したら、実験データはSoft Max PROソフトウェアで直接処理するか、Microsoft Excelなどのスプレッドシートプログラムにコピーして貼り付けることができます。

データを分析するために、記載の手順に従い、最小二乗法を用いてTRPA1アゴニストであるフルフェノミック酸およびTRPA1アンタゴニスト候補化合物Aの濃度反応曲線を生成します。TRPA1はカルシウム透過性カチオンチャネルであり、その活性化によってカルシウム流入が起こり、これはカルシウム感受性色素Fluo-4 AMで検出可能です。一連のフルフェノミック酸（FFA）濃度に対する蛍光変化の経時的な代表的トレースが示されています。高濃度では、ピーク蛍光レベルは同等であるにもかかわらず、FFAによって誘発される蛍光増加の速度論は低濃度時よりも大幅に速くなります。

これらの違いを区別するため、蛍光増加の初期速度を測定して濃度反応曲線を作成しました。様々な濃度のFFAを添加したところ、FFAの半最大有効濃度は55.4 micromolarであると決定されました。また、想定されるTRPA1アンタゴニストである化合物AによるFFA誘発カルシウム反応の抑制に関する濃度反応関係も示されています。

用量依存的に、trip A one細胞のFFAに対する反応が抑制され、半最大抑制濃度は4.3 micromolarでした。このビデオを視聴することで、flag station threeを用いてtriple A oneおよび関連チャネルの薬理学的プロファイルを研究する方法について、十分に理解できるはずです。