Name: FlexStation 3を用いてTRPチャネルの機能のハイスループットスクリーニングへの媒体のためのセルベースカルシウムアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学ぶ TRPA1チャネルの薬理学的プロファイルをFlexStation 3を用いた細胞ベースカルシウムアッセイで。Fluo-4 AMを使った高スループットスクリーニング法が創薬研究に有用です。

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我々は、博士に感謝する。ジョンハンコック、レイグリル、アンドリューモリスとその支援のためのオルガChumakova。 FlexStation 3システムはUTHSC Cytodynamicイメージング施設の一部です。我々はまた、博士に感謝します。スクリップス研究所とHEK293 - hTRPA1安定した細胞株を提供するためのノバルティス研究財団（GNF）のゲノム研究所からArdem PatapoutianとマイケルBandell。研究は、NIH（MXZにGM081658）とテキサスメディカルセンター消化器病センター（HH）およびミッション接続/ TIRR財団（HHまで）からの助成金によって部分的にサポートされています。

1。 96ウェルプレートでの細胞の調製品 一時的にcDNAをヒトのTRPA1とtrasfected HEK293細胞用 <ol><li> HEK293細胞は、10％熱不活化ウシ胎児血清（Invitrogen社、16000から044）を添加した4.5 mg / mlのグルコースを（サーモサイエンティフィック、SH3002201）を含むダ​​ルベッコの最小必須培地（DMEM）、で1〜2日間、50ユニットのために栽培されている/ mlペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン（Invitrogen社、15140から163）。トランスフェクション当日に、細胞密度が70〜90パーセントに到達する必要があります。 </li><li>コー​​ト96ウェルの各ウェルに50μlのポリ- L -オルニチン（シグマP3655、滅菌蒸留水で20μg/ ml）をピペッティングし、37℃でインキュベートすることによりプレート℃で少なくとも15分間。のMg 2 +とCa 2 +（サーモサイエンティフィック、SH3002803）なし（DPBS）緩衝生理食塩水ダルベッコのリン酸で一回の各ウェルをリンス。プレートは、数時間のための細胞培養フードのままになることがあります。 </li><li> 96ウェルプレートの各ウェルについて、1.5 mlのエッペンドルフチュー​​ブに25μlのOPTI - MEM（Invitrogen社、31985から070）のcDNAは0.2μgで希釈する。同じcDNAでトランスフェクトされる井戸の数に応じて比例的にスケールアップ。また、別の1.5 mlエッペンドルフチュー​​ブにトランスフェクトされる各ウェルに25μlのOPTI - MEM 0.4μlをリポフェクトアミン2000（インビトロジェン社、11668から019）で希釈する。このアップトランスフェクトされる井戸の総数に応じて拡大縮小します。 </li><li>簡潔に渦希釈したcDNAとリポフェクトアミン2000を、それらが約5分間室温で放置します。 </li><li>希釈cDNAを、渦を含むチューブに希釈リポフェクタミン2000の等量を転送し、混合物を15分〜2時間室温で放置します。この時間の間に、49μL/ウェルポリ- L -オルニチン被覆プレートへのcDNA /リポフェクタミン2000混合物を転送する。 </li><li> HEK293細胞を（ステップ1.1）トリプシン、血球計算盤または伯爵自動細胞計数装置（Invitrogen社、C10227）を用いて細胞密度をカウントし、15 mlの滅菌に（一般的には約〜125,000-150,000細胞/ウェル）の細胞の所望量を転送する円錐底遠沈管。 5分間1000 × rpmで遠心。 10％熱不活性化ウシ胎児血清を添加したDMEM培地で〜1,250,00-1,500,000細胞/ ml、、で、抗生物質なしで再懸濁し、細胞。 </li><li>マルチチャンネルピペッターまたはMicroFillのマイクロプレートディスペンサー（バイオテック）を用いてcDNA -リポフェクタミン2000混合物を含む各ウェルに98μlの細胞懸濁液を分注する。プレートは加湿細胞培養インキュベーターにそれを配置する前に少なくとも30分間フードに座ってみましょう。 37℃、20〜44時間、5％のCO 2を 。 </li></ol> 安定的にTRPA1を発現するHEK293細胞について <ol start="8"><li>コー​​ト96ウェルプレートにステップ1.2に従ってください。 </li><li>誘導HEK293 - hTRPA1細胞株は、寛大に（Invitrogen社、博士A. Patapoutian（​​スクリプス研究所）によって提供され、野生型HEK293細胞（ステップ1.1）と同じ培地中で維持が、5μg/ mlのブラストサイジンを添加したA1113902）及び50μg/ mlのハイグロマイシンB（Invitrogen社、10687010）。細胞密度が約90％に達すると、細胞をトリプシン、細胞密度をカウントし、5分間1000 × RPMでの細胞の所望量を遠心してください。ドキシサイクリン（フィッシャー、BP265​​35、0.25μg/ ml）を補充した同じ培地で〜1,000,000セル/ mlの密度で細胞を再懸濁します。 </li><li> /ウェルマルチチャンネルピペッターまたはMicroFill（バイオテック）を用いて100℃、ポリ- L -オルニチン被覆されたプレートに細胞懸濁液を分注する。プレートは加湿細胞培養インキュベーターにそれを配置する前に少なくとも30分間フードに座ってみましょう。 37℃16℃、5％CO 2 - 24時間を。 </li></ol> 2。ソリューション<ol><li>ハンクのバッファ塩溶液（HBSS）は細胞外液として使用されます。それは（mMで）含まれています：137のNaCl、5.4 KClを、0.25のNa 2 HPO 4、0.44 KH 2 PO 4、1.3のCaCl 2、1.0のMgSO 4、1.0を1N NaOHを用いて7.4に調整pHを持つのMgCl 2、10グルコース、10 HEPES、）。 </li><li>であるFluo - 4アッセイ用緩衝液は、HBSSでプロベネシド2mMのが含まれています。 0.5 N NaOH中の250mM株式プロベネシド（Sigma社、P8761）を作る。 1:125の割合でHBSSに希釈する。 1 N HClを用いて7.4のpHを再調整してください。 </li></ol> 3。であるFluo - 4 AMで細胞ローディング<ol><li> 1mMのストック溶液を作るために912μlの無水DMSOには1mgであるFluo - 4 AM（Invitrogen社、F14202）を溶かす。であるFluo - 4原液が少なくとも一ヶ月は-20℃で保存できる回答。 </li><li> 5ミリリットルにみたFluo - 4アッセイバッファー（ステップ2.2）に全体の内容を転送して10μlのプルロニックF - 127（Invitrogen社、P3000MP、DMSOの20％（w / v）溶液）でAMおよび10μlの1mMのであるFluo - 4をミックス（Sigma社、A9418）0.1％ウシ血清アルブミンを補充した。 </li><li> 80μlの/ウェルマイクロプレートウォッシャーを（そのようなバイオテックからELx405TMなど）を使用して2回で、HBSSで96ウェルプレート（ステップ1.7または1.10）で培養した細胞を洗浄する。 </li><li>フルオを追加-4 /ウェルマルチチャンネルピペッターまたはMicroFill（バイオテック）を使用して、37でプレートをインキュベート50℃（ステップ3.2）ソリューションをロードした° Cで1​​時間。 </li><li> ELx405TMマイクロプレートウォッシャーを使用してみたFluo - 4アッセイバッファー（ステップ2.2。）で細胞を3回洗浄。最後の洗浄の後、各ウェルにみたFluo - 4アッセイ用緩衝液80μlを残す。 </li></ol> 4。化合物のプレートの準備<ol><li> 1時間のセルローディング期間中に、みたFluo - 4アッセイ緩​​衝液中の所望の最終濃度の3倍のアゴニスト（または拮抗薬）の3倍希釈系列を用意する。 </li><li> 96ウェル化合物のプレートに希釈化合物溶液のピペット250〜300μL。 FlexStation 3が一度に1つの列を読み取るために、可能な限り複合板の同じ列にある化合物と対応するポジティブおよびネガティブコントロールの希釈系列を持つように手配する。 </li></ol> 5。 FlexStation 3のプレートの読み取り<ol><li>システムの電源を入れます（FlexStation 3、コンピュータ、およびソフトマックスプロ5.2ソフトウェア） </li><li>新しいファイル名で実験を保存します。セットアップでは、フレックスモードを選択し、次の値を入力します。 </li></ol> プロトコール＃1、アゴニストの効果 <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table1.jpg" alt="表1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="表1"> プロトコル＃2、アンタゴニスト作用 <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table2.jpg" alt="表2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="表2"><ol start="3"><li> FlexStation 3の適切なトレイに新しいヒントボックス、化合物のプレートと読んでプレートを置き、ボタンを"読み"をクリックします。 FlexStation 3は、一度に1列を読んで、読書を中断することなく、あらかじめプログラムされた時点での化合物を追加します。これは、1つの列とマシンがすべての列が読み取られるまで、ステップ5.2のユーザーによってプログラムが実行化合物の追加と次の列を読み取るために引き続きを読み終えるには約3分（議定書＃2の5分）かかります。 </li></ol> 6。データの分析<ol><li>実験データは、Microsoft Excelなどの、任意のスプレッドシートプログラムに直接ソフトマックスプロ5.2ソフトウェアを使用して処理するかコピー＆ペーストすることができます。 TRPA1アゴニストフルフェナム酸（FFA）の濃度 - 反応曲線は、次の最小二乗フィッティングルーチンを使用して構築されます。 <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq1.jpg" alt="式1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="式1"> 、Yは観測された応答である場合、Y maxは、正規化最大の応答である、Cは対応する薬剤の濃度であり、EC 50は最大値の半分の応答を誘発濃度であり、n Hは見かけヒル係数である。 （100μM）FFAの一定濃度を使用して、そして徐々に次のように当てはめ、最小二乗により計算される化合物の化合物AのIC 50値の濃度を増加させることにより得られる推定TRPA1アンタゴニスト化合物の濃度-阻害曲線方程式。 <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq2.jpg" alt="式2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="式2"> 、Yは観測された応答であり、Y maxは正規化ピーク応答である、[Antは]対応する化合物の濃度である、IC 50は FFA -誘発反応の最大阻害の半分を生産する拮抗薬の濃度であり、そしてnはHが明らかヒルです係数。 </li></ol> 7。代表的な結果： TRPA1は、Ca 2 +感受性色素、フルオ- 4（1-2）によって検出することができるカルシウムの流入につながる活性化、そのうちのCa 2 +透過性陽イオンチャネルである。 HEK293 - hTRPA1安定した細胞株は、TRPA1アゴニストおよびアンタゴニストの濃度 - 反応関係を研究するために使用されていました。細胞は、みたFluo - 4 AMをロードアッセイバッファー80μlの内に置かれ、FlexStation 3を使って読んでいた。 30秒のベースラインの蛍光を記録した後、TRPA1アゴニスト、FFA、所望の最終濃度の3倍で、それぞれの連続希釈の40μlをマルチチャンネルピペッターを介して細胞に添加した流体のモジュールの一部として含まれFlexStation 3。蛍光の変化は、さらに180秒間モニターした相対的にみたFluo - 4各ウェルの蛍光の変化はΔF=として表現された（F - F 0）、FとF 0はそれぞれ、興味や読書の始まりの時の蛍光値です。 FFA濃度の一連の反応の蛍光変化に時間のコースの代表的なトレースが図に示されています。 1。最大応答レベルは似ていますが、活性化速度論が低いFFAの濃度でより高いで明らかに速いですが、最後の4つのFFA濃度のために注意してください。したがって、これらの違いを区別するために、濃度 - 反応関係は、FFAの様々な濃度（図2）の添加により蛍光増の初速度を（傾き）を測定することによって構築した。半最大効果FFAのIVEの濃度（EC 50）が 55.4μM（N = 3）であると決定された。推定TRPA1アンタゴニストをテストするには、化合物、我々はプロトコル＃2（ステップ2）を使用して同様の実験を行った。このケースでは、拮抗薬の希釈系列を30秒（3倍の所望の最終濃度の40μl）で添加し、FFAは（100μMの最終濃度は300μMで60μl）を180秒後に追加されました。化合物Aは用量依存的に4.3μMの半最大阻害濃度（IC 50）（n = 3）を（図2）とFFAにTRPA1の細胞の応答を減少させる。 <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1濃度に依存するFFAによるヒトTRPA1の活性化。トレースは、時間の経過とともに蛍光のFFA誘発増加（最初の60秒でだけ応答が良くFFA -誘発反応の速い反応速度を示すために掲載されています）です。高濃度でFFAがピーク蛍光レベルが類似していたにもかかわらず、はるかに高速に運動低濃度でよりと蛍光の増加を誘発ことに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> 図2集中- 。FFA誘起蛍光の変化と化合物安定HEK293細胞で発現されたヒトTRPA1のFFAの応答の誘発抑制のための反応関係。 Δ、濃度 - FFAの反応関係は、FFAの濃度を変化させる添加時に正規化された蛍光増の初速度を（傾き）を測定することによって決定した。 O、推定されるTRPA1拮抗薬によってFFA誘発カルシウム応答の阻害の濃度 - 反応関係、化合物Aの

<ol><li>Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRPA1+channels+by+fenamate+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).</li>
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<li>Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+high+throughput+screening+assays+against+three+subtypes+of+Ca%28v%293+T-type+channels+using+molecular+and+pharmacologic+approaches.+Assay+Drug+Dev+Technol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol.</a> 5, 191-203 (2007).</li>
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<li>Nanda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+of+adrenergic+receptors+by+measuring+intracellular+calcium+using+the+FlexStation+scanning+fluorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter.</a> Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

細胞内Ca 2 +などの神経伝達物質放出（3）、心臓の活動電位（4）、筋細胞の収縮（5）、細胞のシグナル伝達（6-7）、と興奮細胞死（のような多くの生理学的および病理学的条件下において重要な役割を果たしている8）。細胞内Ca 2 +濃度の測定は、機能+透過チャネルが細胞膜や細胞内小器官のCa 2 +の変化との寄与を解明するのに役立ちます 上記のプロセス（9-13）へのCa 2 +。アッセイはまた、その多くは、Gタンパク質共役型受容体の機能を調べる活性化により、+店舗細胞内Ca 2からのCa 2 +を放出や他のCa 2を活性化することによって細胞内遊離Ca 2 +濃度の増加につながるために使用することができます+透過性のイオンチャネル（14-16）。 FlexStation 3はCa 2 +の使用+細胞内Ca 2 +濃度の増加...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> FlexStation 3 </td><td>分子デバイス</td><td> FLEX3 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェル、FlexStationのピペットチップ</td><td>分子デバイス</td><td> 9000-0912 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェルプレート</td><td>グライナーバイオワン</td><td> 655090 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェルクリアフラットボトムプレート</td><td>共演スター</td><td> 3595 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 12430-104 </td><td></td></tr><tr><td>のOpti - MEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン2000 </td><td>インビトロジェン</td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> AM蛍光- 4 </td><td>インビトロジェン</td><td> F14202 </td><td></td></tr><tr><td> PluronicF - 127 </td><td>インビトロジェン</td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td>ポリ- L -オルニチン</td><td>シグマ</td><td> P36551 </td><td></td></tr><tr><td>プロベネシド</td><td>シグマ</td><td> P8761 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td> A9418 </td><td></td></tr></tbody></table>

flexstation 3を用いてtrpチャネルの機能のハイスループットスクリーニングへの媒体のためのセルベースカルシウムアッセイ

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

分子デバイス&quot;FlexStation 3は、マルチウェルプレートの自動蛍光測定が可能な卓上型マルチモードマイクロプレートリーダーです。それは学術的設定の中〜高スループットスクリーン用に最適です。それは、マルチチャンネルピペッターやマシンを装備した統合型流体転送モジュールは、蛍光試薬の様々な蛍光の変化を監視するために一度に1列を読み取りますいます。例えば、FlexStation 3 +透過性のイオンチャンネルとGタンパク質共役型受容体細胞内遊離Ca 2 +濃度の変化を測定することにより、Ca 2 +の機能を研究するために使用されています。一過性受容体電位（TRP）チャネルは、多くの生理学的および病態生理学的機能に重要な役割を果たす非選択的カチオンチャネルの大きなファミリーです。 TRPチャネルのほとんどはカルシウム透過性であると活性化によりカルシウム流入を引き起こす。このビデオでは、我々はTRPA1チャネル、多数の有害な刺激のための分子センサーの薬理学的特性を研究するためにFlexStation 3のアプリケーションを示しています。 96ウェルプレートで培養一過性または安定的に人間のTRPA1チャネルを発現するHEK293細胞を、、のCa 2 +感受性蛍光色素、みたFluo - 4にロードされ、そしてこれらの細胞のリアルタイム蛍光の変化はのアプリケーションの実行前と実行中に測定されていますFlexStation 3のFLEXモードを使用して、TRPA1アゴニスト。推定されるTRPA1拮抗薬の効果に​​ついても検討した。データは、TRPA1活性化因子と阻害剤の濃度 - 反応関係を構築するためにSoftMax Proソフトウェアから転送されます。

このビデオでは、FlexStation 3を用いて、ヒトTRPA1チャネルの薬理学的特性を研究するための詳細なプロトコルを提供します。プロトコルは、細胞調製、染料ロードとマイクロプレートリーダー、FlexStation 3の動作の詳細について説明します。

FlexStation 3を用いてTRPチャネルの機能のハイスループットスクリーニングへの媒体のためのセルベースカルシウムアッセイ

Molecular Devices社のFlexStation 3は、マルチウェルプレートにおける蛍光測定の自動化が可能な卓上マルチモードマイクロプレートリーダーです。これは...

本手順の全体的な目的は、Flex Station 3を用いて、一過性受容体電位（transient receptor potential）またはTRPA1チャネルの薬理学的プロファイルを研究するためのアプリケーションを実証することです。これは、まず96ウェルマイクロタイタープレートにTRPA1チャネルを発現させた細胞を調製することによって達成されます。マイクロプレートウォッシャーで細胞を洗浄した後、カルシウム感受性蛍光色素を細胞にロードします。細胞のロード期間に続き、さらに数回の洗浄を行います。手順の次のステップは、トリプトファン1アゴニストおよび推定トリプトファン1アンタゴニストを含む化合物プレートを準備することです。最終ステップとして、Flex Station threeシステムでのプレート読み取り用にソフトウェアパラメータを設定します。最終的に、フルフォネミック酸によるTRPA1活性化およびアンタゴニスト化合物Aによる抑制の用量反応関係を示す結果を得ることができます。この手法は、カルシウム流入を測定することでTRPA1の活性化メカニズムに関する知見を提供できるだけでなく、カルシウム感受性蛍光色素や膜電位色素を用いることで、他のカルシウム透過性イオンチャネルやGタンパク質共役受容体の機能を研究することにも適用可能です。この手法の既存のカルシウムイメージングや手動パッチマッピングなどの方法に対する主な利点は、この時間短縮技術により、カルシウムフォーミュラ、鉄チャネル、およびその他のCa動員受容体の機能および調節を高スループットでスクリーニングできることです。本プロトコルの開始前に、書面プロトコルに従い、trip A oneを安定的に導入したHEC 2 93細胞を70から90%の密度まで培養してください。カルシウムアッセイのための細胞調製を開始するには、96ウェルプレートの各ウェルにpoly L ornithineを50 µLずつ分注してコーティングし、プレートを37 °Cで15分以上インキュベートします。インキュベーション後、KOのリン酸緩衝生理食塩水で細胞を1回洗浄します。トリプシン処理後、HEC 2 93細胞の必要量を15 mLの滅菌済みコニカルチューブに移し、サンプルを遠心分離します。上清を除去し、得られた細胞ペレットを再懸濁します。10%熱不活化ウシ胎児血清を添加したDMEM培地を用い、96ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液を100 µLずつ分注します。マルチチャンネルピペットを使用し、プレートをフード内に少なくとも30分間静置した後、加湿細胞培養インキュベーターに20～44時間安置します。カルシウムアッセイの準備として、まず書面プロトコルに従って溶液を調製します。準備後、1 mMのflu oh 4:00 AM 10 µLとonic. F1 27 10 µLを混合し、その全量を0.1% bovine serum albuminを添加した5 mLのflu oh fourアッセイバッファーに移します。次に、96ウェルプレートで培養した細胞を、マイクロプレートウォッシャーを用いてHBSSで1ウェルあたり80 µLで2回洗浄します。洗浄後、マルチチャンネルピペッターを使用してFluo-4 AMローディング溶液を1ウェルあたり50 µL添加し、プレートを37 °Cで1時間インキュベートします。この1時間の細胞ローディング時間中に、アゴニストの3倍濃度溶液シリーズ、アンタゴニストの3倍濃度溶液シリーズ、およびFluo-4アッセイバッファーで調製した300 µMアゴニストの大容量溶液を準備します。希釈した化合物溶液300 µLを96ウェル化合物プレートに分注します。可能な限り、化合物の連続希釈系列と、それに対応する陽性対照および陰性対照が化合物プレートの同じ列に配置されるようにしてください。Flex station 3は一度に1列ずつ読み取るため、最終的な細胞調製ステップとして、アンタゴニストを含む各ウェルの隣に300 µMのアゴニスト溶液300 µLをピペッティングします。マイクロプレートウォッシャーを用いて、ロードした細胞をflu oh four acid bufferで3回洗浄し、最後の洗浄後に各ウェルに80 µLのflu oh four acid bufferを残します。プレートの読み取りを開始するため、Flex Station threeシステムを起動し、soft max Pro 5.2ソフトウェアを立ち上げます。セットアップ時に、新しいファイル名で実験を保存します。フレックスモードを選択し、書面の手順に記載されている通り、アゴニストおよびアンタゴニストの効果を測定するためのパラメータを入力します。次に、新しいチップボックス、化合物プレート、および測定用プレートをフレックスステーションの適切なトレイに配置します。3。Soft Max Proソフトウェアのリードボタンをクリックして、プレートの読み取りを開始します。Flex Station 3は、読み取りを中断することなく、1列ずつ読み取りを行いながら、あらかじめプログラムされたタイムポイントで化合物を添加します。ランが完了後、実験データはSoft Max PROソフトウェアで直接処理するか、Microsoft Excelなどの表計算プログラムにコピー＆ペーストして使用できます。データを解析するために、記述された手順に従い、最小二乗法を用いてTrip1アゴニストであるフルフォネミック酸およびTrip1アンタゴニストと想定される化合物Aの濃度反応曲線を作成します。Trip1はカルシウム透過性カチオンチャネルであり、その活性化によりカルシウム流入が起こり、これはカルシウム感受性色素であるFluo-4 AMによって検出可能です。一連のフルフォネミック酸（FFA）濃度に対する蛍光変化のタイムコースの代表的なトレースを、高濃度側で示しています。FFAによって誘発される蛍光増加は、ピーク蛍光レベルが同等であるにもかかわらず、低濃度時に比べてはるかに速いキネティクスを示します。これらの違いを区別するため、蛍光増加の初期速度を測定することで濃度応答曲線を作成しました。さまざまな濃度のFFAを添加したところ、FFAの半最大有効濃度は55.4 micromolarと決定されました。また、推定されるTRPA1アンタゴニストである化合物Aによる、FFA誘発性カルシウム応答の抑制に関する濃度応答関係も示されています。ある用量において、trip A one細胞のFFAに対する反応が独立して抑制され、半数最大抑制濃度は4.3 micromolarでした。このビデオを視聴することで、flag station threeを用いてtriple A oneおよび関連チャネルの薬理学的プロファイルを研究する方法について、十分な理解を得ることができるはずです。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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キネティック蛍光ベースの Ca2 +動員試金 G タンパク質共役受容体アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック変調器を識別するために

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このプロトコルは、膜電位の変化を測定することによって電気発生膜タンパク質を研究するための方法を記載しています。このアッセイは、上皮細胞株で内因的に発現する複数のイオンチャネルの機能的読み出しのためのプラットフォームを提供します。...

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学ぶ TRPA1チャネルの薬理学的プロファイルをFlexStation 3を用いた細胞ベースカルシウムアッセイで。Fluo-4 AMを使った高スループットスクリーニング法が創薬研究に有用です。

FlexStation 3を用いてTRPチャネルの機能のハイスループットスクリーニングへの媒体のためのセルベースカルシウムアッセイ

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