網膜シナプスにおける神経伝達物質受容体の高解像度イメージング

電子顕微鏡グリッド上のマウス網膜切片を取ります。このセクションには、双極細胞にシナプス的に結合した網膜神経節細胞(RGC)が含まれています。

シナプス前双極細胞には、シナプス膜の近くにリボン構造に配置された神経伝達物質小胞が含まれています。

シナプス後RGCは、膜上にクラスター化された神経伝達物質受容体を示します。これらの細胞は、コレラ毒素サブユニットBまたはCTBで標識されています。

pHを維持するためにバッファーで洗浄します。

ブロッキングバッファーと一緒にインキュベートして、非特異的結合部位をマスクします。

神経伝達物質受容体およびCTBを標的とする一次抗体とインキュベートします。

バッファーで洗浄して、結合していない抗体を除去し、pHを維持します。

異なるサイズの金ナノ粒子に結合した二次抗体とインキュベートし、一次抗体に結合して標的分子を標識します。

結合していない抗体を除去し、サンプルを自然乾燥させます。

高分子に結合する重金属を塗布し、コントラストを高めます。

電子顕微鏡を使用して、標識されたCTBを使用してRGCを同定し、標識された神経伝達物質受容体を見つけます。

このステップでは、厚さ70ナノメートルの超薄い切片をウルトラミクロトームで切断し、Formvarカーボンコーティングされたニッケルグリッドに収集します。グリッドを蒸留水で1回洗浄し、その後TBSを3回洗浄します。次に、グリッドをTBS中の20マイクロリットルの5%BSAで30分間インキュベートし、次にヤギ抗CTBと1つのNMDARサブユニットに対する抗体を含む混合物20マイクロリットルで室温で一晩インキュベートします。

その後、pH 7.6で毎回20マイクロリットルのTBSでグリッドを3回洗浄します。続いて、グリッドを pH 8.2 の TBS で 5 分間 1 回洗浄します。10ナノメートルの金粒子に結合したロバ抗ウサギIgG、および18ナノメートルの金粒子に結合したロバ抗ヤギIgGを含む20マイクロリットルの混合物でグリッドを2時間インキュベートします。

2時間後、20マイクロリットルのTBSでpH 7.6でグリッドを3回洗浄し、続いて超純水で洗浄します。そして、グリッドを自然乾燥させます。続いて、5%酢酸ウラニルを蒸留水中で8分間グリッドに対比染色し、続いて0.3%クエン酸鉛を蒸留水中で暗所で5分間対比染色します。