組換え細胞における匂い物質受容体活性化のリアルタイムモニタリング

発光基質であるルシフェリンを添加した刺激溶液に接着組換え哺乳類細胞を含むマルチウェルプレートから始めます。

細胞へのルシフェリンの侵入を可能にするためにインキュベートします。

これらの細胞は、嗅覚Gタンパク質および受容体輸送タンパク質と結合した膜結合臭気受容体を発現します。

さらに、細胞は細胞質グロセンサータンパク質、環状AMPに感受性のある発光タンパク質を発現します。

ウェル間のスペースに気化可能な臭気剤溶液を加え、同じ臭気剤で事前に平衡化されたルミノメーター機器内にプレートを置きます。

発光測定を開始します。

匂い分子は細胞の匂い受容体に結合し、結合したGタンパク質を活性化し、Gタンパク質のαサブユニット(Gα)を解離します。

解離したGαサブユニットは、膜包埋アデニル酸シクラーゼ酵素に結合し、活性化します。活性化された酵素はATPを環状AMPに変換します。

これらの環状AMPはグロセンサータンパク質と結合し、そのコンフォメーションを変化させ、ルシフェリン結合を可能にします。

この相互作用は発光を生成し、臭気受容体の活性化を確認します。

75マイクロリットルのcAMP試薬溶液を加えます。ウェルから刺激溶液を取り出し、25マイクロリットルの希釈したcAMP試薬溶液を各ウェルに加えます。96ウェルプレートを室温で暗く臭いのない環境で2時間インキュベートします。

まず、臭気剤アセトフェノンを10ミリリットルの鉱物油で1%に希釈し、チューブにキャップを閉めます。cAMP試薬のインキュベーション時間が終了する前に、新しい96ウェルプレートの各ウェルに25マイクロリットルの臭気剤溶液を加えます。次に、この臭気プレートをルミノメーターチャンバーに5分間置き、チャンバーを揮発性臭気分子で平衡化します。90秒のプレート測定の20サイクルで、サイクル間の間隔は0.7秒で、0秒の遅延で発光を記録するようにルミノメーターを設定します。

プレートを読み取る直前に、チャンバーから臭気プレートを取り外します。トランスフェクトされた細胞を含む96ウェルプレートに、ウェル間のスペースに25マイクロリットルの臭気剤を加え、プレートをすばやくチャンバーに戻します。30分以内にすべてのウェルの発光測定を20サイクル開始します。