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血液脳関門の内皮細胞層を模倣した、ラット脳微小血管内皮細胞(RBMEC)の単層培養を含むチャンバースライドを取ります。
細胞は、酸素-グルコース欠乏とそれに続く再酸素化によるストレスにより、タイトジャンクションタンパク質とアクチンストレス線維の破壊を示します。
培地を取り除いて細胞を洗浄し、固定剤を塗布して細胞構造を維持し、余分な固定液を洗い流します。
細胞膜を透過性化するために洗剤で処理します。
ブロッキング剤と一緒にインキュベートして、非特異的結合部位をマスクします。
タイトジャンクションタンパク質を標識するには、特定の一次抗体とインキュベートしてから、結合していない抗体を除去します。
蛍光色素結合二次抗体とインキュベートして、一次抗体を標識します。
または、ストレス線維を標識するには、蛍光色素タグ付きファロイジンを追加します。
結合していない標識分子を除去するには洗浄します。
チャンバーを取り外し、蛍光DNA結合色素を含む封入剤を塗布して核を染色し、カバーガラスで密封します。
共焦点顕微鏡を使用して、蛍光標識されたタイトジャンクションタンパク質とストレスファイバーを視覚化します。
RBMEC単層の各ウェルを100〜200マイクロリットルのOpti-MEM還元血清培地にさらすことから始め、1時間インキュベーションを続けます。次に、洗浄ごとにウェルあたり100〜200マイクロリットルのPBSを使用して、チャンバースライドを3回洗浄します。PBS中の4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、スライドを室温で15分間インキュベートします。そして、以前と同じようにPBSで細胞を3回洗い流します。
次に、PBS中の100〜200マイクロリットルの0.5%Triton X-100を各ウェルに適用して細胞を透過処理します。そして、プレートを室温でさらに15分間インキュベートさせます。細胞が透過処理された後、ブロッキング溶液を塗布します。そして、これを室温で1時間細胞に作用させます。
次に、ZO-1タンパク質の免疫蛍光法を実行するか、F-アクチンを標識します。ZO-1の細胞の免疫蛍光を行うには、一次抗体と一緒に摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、固定液を除去するときなど、PBSで細胞を3回洗浄します。次に、細胞を100〜200マイクロリットルのFITCタグ抗ウサギ二次抗体で室温で1時間インキュベートし、ローダミンファロイジンで細胞を標識します。
ブロッキング溶液を1時間適用した後、細胞を1〜200マイクロリットルのローダミンファロイジンに1〜50希釈で、2%BSA PBSで20分間曝露します。二次抗体またはローダミンファロイジンのインキュベーション後、以前と同様にPBSで細胞を再度3回洗浄します。次に、ゴムを剥がしてチャンバーを取り外します。退色防止剤とDAPIを含む媒体を使用して、スライドの取り付けを続行します。60倍の対物レンズで1つの平面で共焦点顕微鏡で細胞を画像化します。