非ヒト霊長類脳組織に対する免疫組織化学の実施

化学的に固定された非ヒト霊長類の脳切片から始めます。

アルデヒドベースの固定剤はタンパク質を架橋し、組織構造を維持しますが、反応性アルデヒド残留物を残します。

洗浄して、組織切片を取り巻く凍結保護層を取り除きます。

還元剤を加えて反応性アルデヒド基を中和し、反応副生成物を生成します。

これらの副産物と余分な還元剤を除去するために洗浄します。

非特異的抗体結合を防ぐためにブロッキング溶液を塗布します。

神経膜の特定の部位に発現するタンパク質を標的とする一次抗体を追加します。

結合していない抗体を除去するために洗浄します。

一次抗体を標的とするビオチン化二次抗体を添加します。

洗浄して結合していない抗体を除去します。

二次抗体に結合するアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体と重ね合わせます。

結合していない複合体を除去するために再度洗浄します。

過酸化水素とともに発色基質を導入します。過酸化水素の存在下では、ペルオキシダーゼ酵素が基質を酸化し、茶色の沈殿物を形成します。

目的領域を含むアクロレイン固定非ヒト霊長類脳の厚さ50ミクロンの切片をPBSを含む12ウェルプレートに移します。フリーフローティングセクションをPBSで室温で5分間3回洗浄します。次に、切片を新たに調製した水素化ホウ素ナトリウム溶液中で室温で30分間インキュベートします。カバーなしで優しく揺

30分が経過したら、水素化ホウ素ナトリウムを吸引し、各ウェルにPBSを加えます。プレートをロッカーの上に置き、10分間激しく振ってください。さらに2回、または反応ガスが残らなくなるまで洗浄を繰り返します。2%の正常血清と0.5%のコールドフィッシュゼラチンの溶液でインキュベートし、室温で1時間希釈し、穏やかに揺らして切片をブロックします。

インキュベーション時間が経過したら、切片と一次抗体溶液を室温で一晩穏やかに揺らしながらインキュベートします。翌日、切片を以前と同様に洗浄した後、切片を二次抗体溶液中で室温で1.5時間、穏やかに揺らしながらインキュベートします。以前と同様に切片を洗浄した後、アビジンビオチンペルオキシダーゼまたはABC溶液でロッキングしながら1時間インキュベートします。

次に、0.05% 3,3-ジアミノベンジジンと 0.005% 過酸化水素を TBS で希釈した新鮮な溶液を調製します。洗浄後、切片をDAB溶液中で3〜7分間、穏やかに揺らしながらインキュベートします。茶色の沈殿物が目的の色に発達したら、冷たいTBSで2回素早く洗浄し、次に一連の時間制限のあるTBSおよびPB洗浄で