脳腫瘍ニューロスフェア切片におけるバイオマーカーの免疫組織化学的染色

腫瘍特異的な核タンパク質バイオマーカーを示す神経幹細胞のクラスターである脳腫瘍神経球のパラフィン包埋切片を含むスライドを取ります。

加熱してパラフィンを溶かし、キシレンを使用して除去し、アルコール濃度を下げて組織を再水和します。

界面活性剤を含む酸性緩衝液で加熱して、バイオマーカー上のエピトープのマスクを解除し、細胞膜を透過します。

すすぎ、酸化剤で処理して内因性ペルオキシダーゼ酵素を不活性化し、非特異的シグナルを防ぎます。

ブロッキング ソリューションを適用して、非特異的結合部位をマスクします。

バイオマーカーエピトープを標的とする一次抗体とインキュベートします。

すすぎ、一次抗体に結合するビオチン結合二次抗体で処理します。

すすぎ、ビオチンに結合するペルオキシダーゼ酵素結合アビジンでインキュベートします。

発色基質と酸化剤を追加します。

ペルオキシダーゼは、薬剤を利用して基質を着色された沈殿物に変換し、バイオマーカーの位置を標識します。

核を対比染色し、組織をアルコールで脱水し、バイオマーカーの分布をイメージングするためのスライドを取り付けます。

まず、スライドを金属製のラックで摂氏60度で20分間インキュベートしてパラフィンを溶かします。次に、Texプロトコルに従って室温で再水和トレインでインキュベートすることにより、スライドを脱パラフィン化しました。非特異的抗体結合を防ぐために、スライドを水道水に保管してください。この後、スライドを摂氏125度のクエン酸緩衝液中で摂氏90度で30秒間10秒間インキュベートします。スライドを冷ましてから、蒸留水で5回すすいでください。

次に、スライドを室温で0.3%過酸化水素で20分間インキュベートします。次に、スライドを洗浄バッファーで5分間3回洗浄し、穏やかに攪拌します。希釈した一次抗体とともに摂氏4度に設定された加湿チャンバーでスライドを一晩インキュベートします。この後、スライドを5分間3回洗い、穏やかにかき混

ぜます。

次に、希釈したビオチン化二次抗体でスライドを室温で1時間インキュベートします。スライドを洗浄バッファーで5分間3回洗浄し、穏やかに攪拌します。次に、スライドをアビジンビオチン化西洋わさびペルオキシダーゼ複合体で室温で暗所で1時間インキュベートします。前述のように洗浄を繰り返します。この後、スライドをダブ過酸化水素基質バンドとともに室温で2〜5分間インキュベートします。

スライドを水道水ですすぎ、スライドをヘマトキシリン溶液に浸して対比染色します。次に、水が透明になるまでスライドを水道水でよくすすぎます。Texプロトコルに従ってスライドを脱水します。最後に、キシレンベースの封入剤でスライドをカバースリップし、室温で平らな面で乾燥させます。