マウス海馬ニューロンにおけるシナプス小胞エンドサイトーシスの透過型電子顕微鏡イメージング

まず、西洋わさびペルオキシダーゼまたはHRPを含む高カリウム緩衝液でマウス海馬ニューロンを処理します。

高カリウムはシナプス前ニューロンを脱分極させ、シナプス小胞エキソサイトーシスを引き起こします。次に、ニューロンは、新しく形成された小胞にHRPを組み込むことにより、エンドサイトーシスを通じてシナプス小胞膜を回収します。ニューロンをグルタルアルデヒドで固定し、洗浄して余分なグルタルアルデヒドを取り除きます。

過酸化水素と発色基質を加え、HRPによって酸化されて電子密度の高い沈殿物を形成します。洗浄して未反応の基質を除去します。

四酸化オスミウムで処理して膜のコントラストを高め、余分な試薬を洗い流します。次に、酢酸ウラニルを加えて細胞小器官のコントラストを高めます。

エタノール濃度を上げてニューロンを脱水し、樹脂に埋め込みます。

細胞密集領域を顕微鏡的に識別し、切除します。次に、極薄切片を準備します。

断面を銅グリッドに転写し、造影剤で対比染色します。

透過型電子顕微鏡を使用すると、HRPを含む小胞は電子密度の高い構造として現れます。

1.5ミリリットルの高カリウム刺激溶液を室温で90秒間各ウェルに加えることにより、海馬ニューロン培養を刺激します。このステップでは、pH 7.4で0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液を調製します。細胞を4%グルタルアルデヒドで0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液に室温で少なくとも1時間固定します。

次に、細胞を0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液で毎回7分間洗浄します。その後、DAB溶液を調製し、0.22マイクロメートルフィルターでろ過します。次に、1.5ミリリットルのDAB溶液を摂氏37度で30分間細胞に塗布します。

次に、細胞を0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液で毎回7分間洗浄します。固定後として、ニューロンを1.5ミリリットルの1%四酸化オスミウムとともに、摂氏4度で0.1モルのカコジル酸ナトリウムバッファー中で1時間インキュベートします。

その後、ニューロンを1.5ミリリットルの0.1モルカコジル酸ナトリウム緩衝液で3回、毎回7分間洗浄します。続いて、酢酸ナトリウムと氷酢酸を含む0.1モル酢酸ナトリウム緩衝液を調製します。細胞を1.5ミリリットルの0.1モル酢酸緩衝液で毎回7分間3回洗浄します。

その後、細胞を1.5ミリリットルの1%酢酸ウラニルを0.1モルの酢酸緩衝液中で摂氏4度で1時間インキュベートします。次に、細胞を1.5ミリリットルの0.1モル酢酸緩衝液で毎回7分間3回洗浄します。ヒュームフードで、50%、70%、および90%エタノールの1.5ミリリットルの洗浄でニューロン培養物を1回7分間洗浄し、続いて1.5ミリリットルの100%エタノールで毎回7分間3回洗浄します。

次に、エポキシ樹脂を作り、よく混合し、真空下で保存して気