Name: ヌクレオカプシドからウイルスDNAの調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: 学ぶヘルペスウイルスヌクレオカプシドDNAの抽出法。フレオン抽出と超遠心分離を用いて高純度のウイルスDNAを分離し、PCRやシーケンス解析に適したサンプルを調製する方法を解説する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、このプロトコルを微調整するにグレッグスミス、リサPomeranz、マットライマン、マルリースエルドリッジ、ハリナStaniszewska Goraczniak、およびEnquistラボのメンバーの貢献を感謝しています。

1。一日目：ウイルス感染とバッファーの調製<ol><li>感染の組織培養細胞の5-10皿（15cmの直径を）準備、仮性狂犬病ウイルス（PRV）またはヘルペスのためのVero細胞用例：PK - 15細胞（HSV）ウイルス単純。 </li><li>細胞が95である場合 - 100％コンフルエント、（MOI）50から10の時にそれらを感染させる。これを行うには、プレート当たり4 mlの全体積にウイルスストックを用いて各プレートに接種し、37℃で1時間プレートをインキュベート℃に軽くロックプレート細胞単層はウイルス接種によって完全に被覆されたままであることを保証するために15分ごと。一方、次のステップのための培地を温める。 </li><li>感染症の1時間後には、プレートからウイルス接種物を吸引除去暖かい培地15mlを追加し、37℃の加湿インキュベーター中、12〜20時間のために。 </li><li> LCMバッファ（表1参照）と° C完全に混合するための一晩4石を準備します。ウイルスDNAの再懸濁するためのTNEを準備する（表2参照）。 </li></ol> 2。第二日目、フェーズ1：細胞の溶解および超遠心法<ol><li>視覚的にその細胞の感染は、均一な細胞変性効果（CPE）を起こしていることを確認します。すべての細胞が切り上げているが、プレートから持ち上げていないまで、感染が進行することができます。 </li><li>培地中に感染した細胞をこすり、および50 mlコニカルチューブに細胞や培地を組み合わせる。このステップに必要なコニカルチューブの数が上記のステップ1.2での感染のために使用される料理の数に依存する、 例えば、1つ50 mlコニカルチューブにペレットを15 mlの培地それぞれの3皿の最大を使用することができるオプション：。リンス10ミリリットルPBSでプレートは、細胞と培地との組み合わせ。 </li><li>室温で2000年の相対centifugal力（RCF）で10分間、細胞と培地を遠心し、上清を吸引し、PBSの10mlにそれぞれのペレットを再懸濁します。つのウイルス感染からペレットをステップ2.2で複数のコニカルチューブに広がっていた場合、これらはこのステップに一つコニカルチューブに再結合することができます。遠心分離や吸引を繰り返して、 オプション：このペレットを-20℃で保存し、プロトコルは、後で継続することができる。 </li></ol> 3。第二日目、フェーズ2：超遠心法 次の手順中に、可能な限り氷の上で細胞ペレットとLCMのバッファを保持します。 <ol><li> 0％グリセロールにβ-メルカプトエタノールを追加 - LCMバッファ。に設定することによって超遠心機を（下のステップ3.9の）冷却開始4℃、真空をオンにする。 </li><li> 0％グリセロール5mlの細胞ペレットを - LCMのバッファを、それがこんもり茂ったれなくなるまで。必要に応じて、ボルテックスチューブはどんな溶解していない細胞ペレットを分割する。 </li><li> 1.5 mlのフロン（1,1,2 - トリクロロ-1,2,2 - トリフルオロエタン）を加えて激しくボルテックスで抽出する。すぐに4℃の温度で2000 RCFで10分間遠心操作ワイドボアピペットチップ（インタフェースを避ける）で最上位層を収集し、新しいチューブに移すオプション：。ペレットは、ゼラチン状の固体である場合は、すぐに新しいチューブに最上層を注ぐことができる。 </li><li>再びフロンの抽出と遠心を繰り返します。 </li><li>最上層（〜5 ml）を収集し、新しいポリアロマー超遠心チューブに移す。 LCMバッファ - 残りの2つのグリセロールにβ-メルカプトエタノールを追加。 </li><li> LCM（中間層）し、45％グリセロール2.5 mlで再び基礎となる - - LCM（底層）5％グリセロール3mlでフロンのエキス（最上層）の基礎となることによってポリアロマーの遠心管に勾配を準備します。試験管の内容のオーバーフローを避けるために、細いピペットを使用してください。 </li><li>必要に応じて、LCMバッファの同じ比率を使用して同等のバランスチューブを準備する。 </li><li>超遠心バケットにチューブを移す。最上位層（一度に〜50から100μL）にLCMバッファ - 優しく余分な0％のグリセロールを添加することにより、お互いに0.1gの内にバケツのバランスをとります。 </li><li>水平またはスイングバケットローターで冷たい超遠心機を使用して、4℃の温度で77000 RCF（SW41Tiのローター用など25000 rpm）で1時間のバランスサンプルをスピン</li><li>超遠心分離中に、エタノール沈殿のステップ（下記4.6）に浮遊DNAを捕捉するためにガラスのフックを作る。ガラスパスツールピペットの両端を持ち、火炎上中央のセクションを中断。ガラスのセクションはほとんど溶融の場合は、しっかりと直角フック（&lt;90 °）を作成し、そして終了を封印するために急激に引っ張って軽く曲げ、ガラスを伸ばすために慎重に引き抜いてください。ガラスのフックの先端が開いている場合、ガラスはそれを閉じるのに十分な溶けように炎を介して先端を保持する。 </li><li>超遠心分離した後、中央のダークスポットと薄い不透明なペレットが表示されるはずです。慎重に両側に沿っ余滴を含めて、チューブから液体を吸引除去するが、チューブの底にペレットを避ける。 </li><li>室温で0.5 mlのTNEを追加。 </li><li>ペレットは、ペレットの水和を可能にするために少なくとも10分間放置します。Optional：4で守ればペレットはまた、一晩TNEで再懸濁ができる℃の</li></ol> 4。第三日目："ゴースト"DNAの沈殿<ol><li>小口径のピペットチップ（ 例えば、P200のピペットチップ）でピペッティングしてペレットを破る。ウイルスのDNAがまだこの時点でキャプシドに含まれているため、このステップでせん断を心配しないでください。キャプシドを破壊するために、室温で、ウイルスのペレットを含むチューブに以下の試薬を追加します。 <ul><li> 4.25ミリリットルTNE </li><li> 0.25ミリリットル10％SDS </li><li> 2mgのプロティナーゼK </li></ul>優しくこれらの試薬を混合して揺らし。粘度のわずかな増加があるはずです。 </li></ol> ここからはせん断用心、例えば大口径のピペットを使用してウイルスの材料にボルテックスしないでください <ol start="2"><li>フェノール - クロロホルム5mlを加えることによってウイルスタンパク質を抽出し、即座にエマルジョンを維持するために反転またはボルテックスを開始。室温で2000 rcfで5分間乳化物を遠心分離し、10秒間混ぜる。インタフェースを避け、ワイドボアピペットの先端と上部層を収集し、新しいチューブに移すオプション：使用する位相ロックゲル（PLG）チューブをこの段階でインターフェイスからの汚染を避けるために。 </li><li>再びフェノール - クロロホルム抽出し、遠心を繰り返します。 </li><li>第二フェノール - クロロホルム抽出後、30ミリリットルのガラスCorexチューブに最上層を回収し、10〜15分は-20℃でチューブを冷やし、それが凍結しないように気をつける。 </li><li> 、氷冷エタノール10mlを加え、チューブを（上からパラフィルムMの部分をストレッチするなど ）カバー、そしてすぐに混在させる反転。細い縄状の沈殿物で構成されて表示されるようにDNA"ゴースト"、待ってください。さらにミックスし、粘着性DNAが一緒にクラスタに沈殿させるために軽くチューブを反転。 </li><li> DNAのゴースト（s）をキャプチャするためにガラスのフックを使用してください。慎重に余分な液体を除去するためにDNAをブロット、その後、1.5 mlチューブにフックを（下に傾ける）に置き、乾燥させます。 0.25を追加 - TEの0.5 mlをDNAのゴーストを溶解する。少なくとも1時間進行するDNAの再懸濁を許可する。 4℃店舗のDNA℃のオプション：1.5 mlチューブにガラスのフックを切り離し、DNAの収量を最大にするには、ガラスの破片からなるよう再懸濁は、時間をかけ続けることができます。 </li></ol> 5。代表的な結果 MOI十分に高いと、細胞は野生型PRV株のために〜18時間の感染後（HPI）の中で完全なCPEを達成すべきである、と野生型HSV - 1株（図1）〜24 HPI。一度感染した細胞ペレットが収穫され、残りのプロトコルのステップは長い1日で完全になるか、2日間（図2）を介して実施することができます。 DNAのゴーストをキャプチャするためにガラスのフックを準備するとき、それは後には1.5 mlチューブ（図3）のベースに収まることができるように、90度未満となるフックの角度を作ることが重要です。このフックの先端部をシールするピペット内のDN​​Aの損失を防ぎます。 DNAの幽霊は、沈殿工程中に形成し、白、粘着性の糸（図4）として表示されます。これらの集計とスティック相互に、かつ/またはDNAを捕捉するために使用されるガラスのフック。したがって、同一のガラスのフックは、降水量のソリューションの中から、DNAの複数のスレッドを収集するために使用することができます。 <table border="1"><tbody><tr><td> 希望のボリュームに基づいて列を選択してください。 </td><td> 10ミリリットル </td><td> 15ミリリットル </td><td> 20ミリリットル </td><td> 40ミリリットル </td></tr><tr><td> 1MのKCl </td><td> 1.3ミリリットル</td><td> 1.9ミリリットル</td><td> 2.5ミリリットル</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td> 1Mトリス（pH 7.4） </td><td> 300μlの</td><td> 450μlの</td><td> 600μlの</td><td> 1.2ミリリットル</td></tr><tr><td> 1M MgCl 2の </td><td> 50μlの</td><td> 75μlの</td><td> 100μlの</td><td> 200μlの</td></tr><tr><td> 0.5 EDTA </td><td> 10μlの</td><td> 15μlの</td><td> 20μlの</td><td> 40μlの</td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50μlの</td><td> 75μlの</td><td> 100μlの</td><td> 200μlの</td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール（使用直前に追加） </td><td> 4.3μL </td><td> 6.5μL </td><td> 8.6μL </td><td> 17.2μL </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> 希望するパーセントのグリセロール（0,5、または45％）の割合を使用 </td></tr><tr><td> 0％のグリセロール</td><td>なし</td><td>なし</td><td>なし</td><td>なし</td></tr><tr><td>水を</td><td> 8.3ミリリットル</td><td> 12.5ミリリットル</td><td> 16.7ミリリットル</td><td> 33.4ミリリットル</td></tr><tr><td> 5％のグリセロール</td><td> 0.5ミリリットル</td><td> 0.8ミリリットル</td><td> 1.0ミリリットル</td><td> 2.0ミリリットル</td></tr><tr><td>水を</td><td> 7.8ミリリットル</td><td> 11.7ミリリットル</td><td> 15.7ミリリットル</td><td> 31.4ミリリットル</td></tr><tr><td> 45％のグラムlycerol </td><td> 4.5ミリリットル</td><td> 6.8ミリリットル</td><td> 9.0ミリリットル</td><td> 18.0ミリリットル</td></tr><tr><td>水を</td><td> 3.8ミリリットル</td><td> 5.7ミリリットル</td><td> 7.7ミリリットル</td><td> 15.4ミリリットル</td></tr></tbody></table> 表1。 LCMバッファーの調製のためのレシピ <table border="1"><tbody><tr><td> 50mlの容積のための </td></tr><tr><td> 5ミリリットル1MのNaCl </td></tr><tr><td> 2.5ミリリットル1Mトリス、pH7.5の</td></tr><tr><td> 1ミリリットル0.5 EDTA </td></tr><tr><td> 41.5ミリリットルH 2 O </td></tr></tbody></table> 表2。 TNEの準備 （0.1MのNaCl、50mMトリス、pH7.5の、10mMのEDTA） <table border="1"><tbody><tr><td> 1リットルの容積のための </td></tr><tr><td> 0.2グラムのKCl </td></tr><tr><td> 0.2グラムのKH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8グラムのNaCl </td></tr><tr><td> 1.15グラムのNa 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1LのH 2 O </td></tr></tbody></table> 表3。 PBSの調製 （2.7 mMの塩化カリウム、1.5mMのKH 2 PO 4、137 mMのNaCl、8.1 mMののNa 2 HPO 4、pH7.0）で<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図感染を介して感染前に1。PK15細胞（）、（B）の中間、および（C）細胞変性効果（CPE）で、感染の高い多重度の後。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2プロトコルの概要。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3：ガラスの3つの代表例はウイルスDNAの幽霊を収集するために使用されるフック。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。整形式と豊富なDNA"ゴースト"の代表例。

<ol><li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li>
<li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins%3A+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li>
<li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li>
<li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li>
<li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus%2C+an+alphaherpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus%3A+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li>
<li>Roizman, B., Pellett, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).</li>
<li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li>
<li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li>
<li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このプロトコルの一部は、もともとBSL4条件におけるウイルスDNAの分離のために開発されたが、それは非BSL条件にも同様に適応された4我々は一般的にDNAゲノムを有するα-ヘルペスウイルスPRVおよびHSV - 1、からDNAを単離するためにこのプロトコルを使用キャプシドと脂質エンベロープに囲まれたタンパク質で囲みます。7,8しかし、それが含むβ-およびγ-ヘルペスウイルスやアデノウイルス、おそらく他の大型DNAウイルスに直接適応である。同様の抽出は、一般的にだけでなく、RNAウイルスのために使用されています。9 含まれている精製​​の複数のメソッドからこのDNA調​​製可能性が高い結果の頑健性。初期フロン抽出変性脂質膜、細胞成分を分離し、また、脂質​​エンベロープとヘルペスウイルスのキャプシドを囲む外側のテグメントタンパク質を放出する。これは、重いウイルスのヌクレオカプシドペレットは、2つの勾配のクッションを介して、効果的に他のほとんどの細胞成分からそれらを分離する遠心分離、が続いている。これらのキャプシドは再懸濁...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>フロン（1,1,2 - トリクロロ-1,2,2 - トリフルオロエタン） </td><td>フィッシャー</td><td> T178 - 4 </td><td>フロン含有廃棄物の適正処理に関するガイドラインについては、貴機関に確認し、またはメンデスらを参照してください。潜在的なフロン代替用。9 </td></tr><tr><td>位相ロックゲルチューブ、ヘビー15ミリリットル容量</td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td>オプション</td></tr><tr><td>ポリアロマー超遠心管</td><td>ベックマン* </td><td> 331372 * </td><td> *あなた自身の超遠心分離に適したチューブを選択し、これらは例としてのみ含まれています。 </td></tr><tr><td> NP - 40 / IGEPAL </td><td>シグマ</td><td> I - 3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK - 15細胞</td><td> ATCC </td><td> CCL - 33 </td><td></td></tr><tr><td> Vero細胞</td><td> ATCC </td><td> CCL - 81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

ヌクレオカプシドからウイルスdnaの調製

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

ウイルスは絶対携帯寄生虫であり、そのため、DNAの研究では、離れて宿主細胞の汚染物質とDNAからのウイルス材料を分離する必要があります。いくつかの下流のアプリケーションでは、このプロトコルによって提供される純粋なウイルスDNA、大量のを必要とする。これらのアプリケーションは、ウイルスゲノムの宿主DNAの除去は、ウイルス配列のデータ出力を最適化するために重要であるシーケンシング、および新たなウイルスの組換え株の生産、プラスミドおよびリニアウイルスDNAの組換えを容易に精製されたの共トランスフェクション。1,2を、含まれています3 この手順では、感染細胞からリニアヘルペスウイルスヌクレオキャプシドのDNAを精製単離するために抽出し、密度ベースの遠心分離の組み合わせを採用しています。4,5初期精製ステップは、抽出と遠心操作中に含まれているとウイルスDNAを保護するウイルスキャプシドを、精製分離することを目指すことは、細胞タンパク質およびDNAを除去。ヌクレオカプシドの溶解は、ウイルスDNAを解放し、最後に2つのフェノール - クロロホルムの手順では、残りのタンパク質を除去。ソリューションから取り込んだ最後のDNAは1.90の平均OD 280分の260と、高濃度および純粋です。使用されて感染細胞の量に応じて、150から800μgの以上からウイルスDNAの範囲の収量。このDNAの純度は、4Cでの長期保管中にそれが安定したものになります。このDNAは、このように理想的にハイスループットシーケンシング、高忠実度PCR反応、およびトランスフェクションに適しています。 プロトコルを開始する前に、それは、ディッシュあたりの細胞（コンフルエント15cmの皿に8 × 10 6 PK - 15細胞の平均など）の平均数を知ることは重要です、そして、使用するウイルスストックの力価（例えば、ml当たり1 × 10 8プラーク形成単位を）。これらのプロトコルのために感染症の適切な多重度（MOI）を計算するために必要な。例えば6、上記のウイルスストックとPK - 15細胞の一つ15cmの皿に感染する、MOI 5の時には、400μlのを使用します。ウイルスストックと培地の3.6ミリリットル（一15cmのプレートに4 mlの総接種量）とそれを希釈する。 複数のウイルスDNAの調製物は、同時に調製することができる。同時の準備の数は、超遠心ローターで開催された管の数によって制限されます（ウイルスごとに、下記のステップ3.9を参照してください）​​。ここでは、つのウイルスのために行われているかのように手順を説明します。

我々は、感染細胞から高純度のヘルペスウイルスヌクレオカプシドDNAを単離するプロセスを説明します。ソリューションから取り込んだ最終的なDNAは、それが理想的にハイスループットシーケンシング、高忠実度PCR反応、および新たなウイルスの組換え体を生産するトランスフェクションに最適です、高濃度および純度である。

ヌクレオカプシドからウイルスDNAの調製

ウイルスは絶対細胞内寄生体であり、そのためウイルスのDNAを研究するには、宿主細胞の不純物やDNAからウイルス物質を分離することが必要です。

このビデオでは、感染細胞から高純度のウイルスヌクレオカプシドDNAを単離する手順を実演します。まず、二相抽出法を用いて脂質膜を変性させます。次に、サンプルを超遠心分離し、ウイルスヌクレオカプシドをペレット化することで、より軽い細胞成分およびウイルス成分から分離します。界面活性剤とプロテイナーゼKを添加し、ペレット化したヌクレオカプシドからウイルスDNAを放出させます。次に、フェノール・クロロホルム抽出を2回行い、残存するすべてのタンパク質を除去します。最後に、溶液中でウイルスDNAを沈殿させます。最終的に、これらの感染細胞から、高濃度かつ高純度のウイルスDNAが単離されたことが示されました。遊離DNA抽出や超遠心分離を用いない既存の手法に対する本手法の主な利点は、得られるウイルスDNAに含まれる宿主DNAの混入レベルが非常に低いことであり、PCRやウイルスゲノムのディープシーケンシングなどの下流工程に最適である点にあります。我々は、追加の予防措置が極めて重要であった組換えDNA研究の初期段階で、初めてこの手法を採用しました。BSL-4条件下のグローブボックス内でウイルスDNAを単離するための手順を開発しました。勾配の形成とDNAゴーストの確認ステップは習得が困難であるため、本手法を視覚的に実演することが極めて重要です。これは、勾配の積層には非常に安定した手の動きが求められることと、溶液中で沈殿するDNAゴーストは、その視認に関する経験がない場合には発見が困難であるためです。まず、感染させるために直径15 cmの組織培養細胞ディッシュを5～10枚準備します。ここでは、PK 15細胞が95～100%コンフルエントになった時点で、培地をウイルスを含む4 mLの培地と置換し、擬似狂犬ウイルスを感染させます。MOIを5～10とし、5%CO2の加湿37 °Cインキュベーター内で、15分ごとにプレートを揺らして1時間インキュベートします。プレートを静かに揺らし、細胞単層全体にウイルス接種液が行き渡るようにします。インキュベーションの間、次のステップに使用する培地を温めておきます。感染から1時間後、プレートからウイルス接種液を吸引します。次に、15 millilitersの温まった培地を加え、加湿インキュベーター内で37 °Cで12～20時間インキュベートします。最後に、翌日の実験の準備として、LCMおよびTNEバッファーを新しく調製します。NP 40を添加すると、acquis溶液中にリボン状の凝集体が形成されることに注意してください。調製した溶液をロッカースタンドに載せ、4 °Cで一晩静置します。翌日までに、溶液は完全に混合されているはずです。翌日、ディッシュを複合顕微鏡のステージに載せ、細胞への感染によって均一な細胞変性効果が生じていることを視覚的に確認します。すべての細胞が丸くなっている必要がありますが、プレートから剥がれていてはいけません。細胞がまだ丸くなっていない場合は、細胞変性効果（CPE）が観察されるまでインキュベーションを継続してください。次に、感染細胞をスクレイパーで回収して培地に入れ、回収した細胞を含む培地を50 milliliterのコニカルチューブにまとめ、収量を高めます。プレートを10 millilitersのPBSで洗浄し、培地中の細胞と合わせます。その後、室温にて2000 RCFで10分間、細胞と培地を遠心分離して、残った培地と血清を洗浄し、上清を吸引して、ペレットを10 millilitersのPBSで再懸濁します。遠心分離と吸引を繰り返します。当日中に実験を継続しない場合は、本セクションに示す手順で使用するまで、ペレットをminus 20 degrees Celsiusで保存します。細胞ペレットおよびLCMバッファーは、可能な限り常に氷上で保持することが重要です。0% glycerol LCMバッファーにBemer capto ethanolを加え、Bemer capto ethanolの最終濃度が0.043%になるようにして超遠心分離の準備を行います。また、超遠心機を4°Cに設定し、冷却中に真空ポンプを作動させて準備してください。細胞ペレットに0.043% Bemer capto ethanolを含む0% glycerol LCMバッファーを5 mL加え、ピペッティングしてペレットを再懸濁させます。必要に応じて、凝集塊をすべて完全に分散させてください。チューブをボルテックスし、未溶解の細胞ペレットを分散させます。次に、細胞膜およびウイルス膜を抽出するため、1.5 millilitersを添加します。すぐに激しくボルテックスします。4 °Cで2000 RCFで10分間遠心分離します。遠心分離後、2つの層に分かれます。上層のクッション層にはウイルスのヌクレオカプシドおよびタンパク質が含まれ、下層のFreon層にはウイルス膜および細胞膜が含まれています。ワイドボアピペットチップを用いて、界面に触れないように上層を回収し、新しい50 milliliterコニカルチューブに移します。Freon層に触れ、その有機溶媒を新しいチューブの上層に混入させないことが重要です。前と同様にフレオンを加え、ボルテックスして、遠心分離後のフレオン抽出を繰り返します。上層を約5 mL回収し、新しいポリアマー超遠心管に移します。残り2つのグリセロールLCMバッファーに、エタノールを0.043%になるように加えます。次に、ポリマー製遠心チューブに密度勾配を作成するため、細いピペットを用いてFreon抽出液の下に3 mLの5% glycerol LCMを静かに加えます。続いて、その下に2.5 mLの45% glycerol LCMを重ねます。また、必要に応じて、同じ割合のLCMバッファーを用いて同等のバランスチューブを準備してください。チューブを超遠心機用バケットに入れ、0% glycerol LCM bufferを上層に50から100 µLずつ慎重に加えて、チューブ間の重量差を0.1 g以内に調整し、バランスを取ります。調整したサンプルを、4 °C、77,000 RCFで1時間超遠心分離します。エタノール沈殿ステップにおいて、浮遊しているDNAを回収するために、ガラスパステールピペットでフックを作製します。ピペットの両端を持ち、中央部分を炎にかざします。ガラス部分が温まったら、ゆっくりと引いてガラスを伸ばします。緩やかに曲げて90度未満の鋭角なフック状にし、素早く引いて先端を封じます。ガラスフックの先端が開いている場合は、先端を炎にかざし、ガラスが十分に溶けて閉じるまで加熱します。超遠心分離後、中央に暗い点がある薄い不透明なペレットが形成されており、そこにはウイルスのヌクレオカプシドが含まれています。チューブの壁面の液滴を含め、チューブ底部のペレットを避けて、液体を慎重に吸引します。室温でTNEを0.5 milliliters加えます。ペレットを10分以上静置し、ペレットを水和させます。翌日まで手順を継続しない場合は、再懸濁したペレットを4 degrees Celsiusで保存してください。P 200チップを使用して、ピぺッティングにより水和したペレットを溶解させます。この段階ではウイルスDNAがまだカプシドに包まれているため、せん断については気にする必要はありません。カプシドを溶解させるために、室温でウイルスペレットに以下のものを加えます：TNE 4.25 milliliters、10%SDS 0.25 milliliters、およびProteinase K 2 milligrams。穏やかに揺らして、これらの試薬を混合します。カプシドが破壊されたため、わずかに粘性が増しているはずです。DNAのせん断を避けるため、広口ピペットを使用し、ウイルス材料をボルテックスせず、ウイルス蛋白を抽出してください。サンプルをフェーズロックゲルチューブに移し、5 mLのフェノール・クロロホルムを加えます。直ちに、転倒混和によりエマルション状態を維持するため、少なくとも10秒間転倒させます。その後、室温にて2000 RCFで5分間、エマルションを遠心分離します。遠心分離後、上層を回収し、新しいフェーズロックゲルチューブに移します。フェノール・クロロホルム抽出を繰り返し、2回目の抽出後、再び遠心分離を行います。上層を30 mLのガラス製コエックスチューブに回収し、-20 °Cで10～15分間冷却します。凍結しないように注意しながら、冷エタノールを10 milliliters加えます。チューブに蓋をして、反転させて混ぜ合わせます。直ちに、細い紐状の沈殿物であるDNAゴーストが現れるかを確認します。チューブをゆっくりと反転させてさらに混ぜ合わせ、粘性のあるDNA沈殿物を凝集させます。最後に、ガラスフックを用いてDNAゴーストを慎重に取り出し、キムワイプで軽く叩くようにして余分な液体を除去し、DNAをブロットします。次に、フックの先端を1.5 mLチューブに入れます。DNAの回収量を最大化するため、ガラスフックを1.5 mLチューブ内で折り曲げ、時間の経過とともにガラス片から再懸濁が進むようにします。乾燥させた後、0.25〜0.5 mLのTE緩衝液を加えてDNAゴーストを溶解させます。DNAの再懸濁を少なくとも1時間行い、4 °Cで保存します。ウイルスDNAは、本ビデオ記事で説明するようにヌクレオカプシドから調製しました。ここでは、溶液中で沈殿した線状のウイルスゲノムDNAからなる、良好に形成され豊富に存在するDNAゴーストの代表例を示しています。DNA鎖は凝集しているため、Acquia溶液に加えた後、再水和させるまでに時間を要します。PRV株であるBecker株、Bartha株、およびその他の4つの株から調製したウイルスDNAを0.5%アガロースゲルで1時間泳動させ、エチジウムブロマイドで染色しました。各PRVサンプルには、1 µLのウイルスDNAヌクレオキャプシド調製液（左側の全量は250 µL）を使用します。λバクテリアファージDNAのラダーにより、未消化のλ DNA（48.5 kb）とPRVゲノムDNA（約140 kb）の大きなサイズが示されています。次に、既知量のLambda DNAの希釈系列を用いて、右側のPRVサンプルの濃度が50から200 ng/µLまで変動し、ウイルスDNA調製1回あたりの総収量が12から50 µgであることを示します。4つのPRV株から調製したウイルスDNAサンプルを、BAM H1またはKPN1のいずれかで一晩消化しました。制限酵素で消化したDNAサンプルを0.8%アガロースゲルで一晩電気泳動により分離し、臭化エチジウムで染色しました。H 1 レーンには 8 µg のウイルスヌクレオカプシド DNA を、KPN 1 レーンには 4 µg のウイルス DNA を含めます。異なる PRV 株は、それぞれの制限断片長多型パターンによって区別できます。この手順に続き、ディープシーケンシングなどの他の手法を行うことで、開発後のウイルスゲノムコンテンツに関するデータを得ることができます。この技術は、ウイルス学分野の研究者が、制限断片長多型（RFLP）、サザンブロッティング、組換え DNA のクローニング、ウイルス構築、およびヘルペスウイルスやその他の種類のウイルスの操作によって、ウイルス DNA を特性解析するための道を切り開きました。fonの取り扱いは極めて危険であるため、本手順を遂行する際は、常にドラフトチャンバー内で作業するなど、適切な予防措置を講じてください。ペレット化後、fon層はゲル状の半固体から液体へと急速に変化する場合があるため、水相の上層を回収する際に、注ぎ出しとピペッティングのどちらが最適であるかは、チューブごとに個別に判断してください。

preparation-of-viral-dna-from-nucleocapsids

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

を経由して植物細胞に複数のウイルス成分の配信を同期化する、シンプルで効率的かつ強力な方法...

シンプルで堅牢な<emin vivoでの>と in vitroで</emウイルスの組み立てを学ぶための>アプローチ

単一のウイルスゲノム（SVG）は、単一のビリオンのゲノムを分離して増幅する方法である。混合された集合体のウイルス懸濁することにより、ビリオンを捕捉し、下流の処理中にゲノムせん断を低減、アガロースを含む個別のウェルを有する顕微鏡スライド上にフローサイトメトリーを用いてソートされる。全ゲノム増幅は、配列決定のために適しているゲノム材料をもたらす複数の置換増幅（MDA）を用いて達成される。...

&#39;シングルウイルスゲノミクス&#39;を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析

このビデオでは、ポジティブセンスの一本鎖RNAウイルスを成体の雄のショウジョウバエにナノインジェクションする手順を説明し、その後、感染によって開始される抗ウイルス反応を研究します。ポリメラーゼ連鎖反応解析により、感染したハエの特定の遺伝子のアップレギュレーションが同定され、RNA干渉やJAK/STATシグナル伝達などの免疫応答経路の活性化が示唆されます。...

成虫のハエにおける宿主とウイルスの相互作用を研究するための胸腔内ウイルスナノ注射

ここでは、日本脳炎ウイルスの正鎖ゲノムRNAの完全長cDNAを含む感染性細菌人工染色体を作成するためのプロトコルが提示されます。このプロトコルは、他のポジティブストランドRNAウイルスの機能的cDNAを構築するために使用できるため、ウイルス生物学を研究するための強力なゲノムツールとなります。...

細菌人工染色体：プラス鎖RNAウイルスの研究のための機能ゲノミクスツール

私たちは、アデノウイルス(Ad)に感染したヒト細胞からウイルス複製コンパートメント（RC）を単離する新しい戦略を提供します。このアプローチは、ウイルスゲノムの複製と発現を調節する分子メカニズム、およびRCで確立されたウイルスと宿主の相互作用の制御を解明するのに役立つ無細胞システムを表しています。...

アデノウイルスに感染したヒト正常細胞からのウイルス複製コンパートメントに富むサブ核画分の単離

宿主細胞へのウイルス侵入中のインフルエンザAウイルスコアの分解は、多段階のプロセスです。ここでは、ウイルスのコーティング解除の初期段階をin...

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

ここでは、バキュロウイルスまたは哺乳動物発現系、および超遠心分離精製のいずれかを使用してウイルス様粒子を合成するためのプロトコルを提示します。この高度にカスタマイズ可能なアプローチは、安全かつ柔軟な方法で、ワクチン標的としてウイルス抗原を同定するために使用されます。...

ワクチン接種のための発現およびウイルス様粒子の精製

このプロトコルは、ヒト臨床分離株からのウイルスサンプルの偏りのないRNAシーケンシングのための迅速で広く適用可能な方法を説明しています。...

臨床サンプルからのRNAウイルスの公平なディープシーケンシング

このプロトコルの目標は、具体的にはタグし、関連付けられているウイルスのゲノムのタンパク質のキャラクタリゼーションのため感染細胞からウイルス DNA...

関連付けられているウイルスおよび細胞タンパク質の同定のウイルス DNA の精製

二本鎖 DNA のゲノムを持つ植物ウイルスを識別するために新しいアプローチをご紹介します。我々 は感染葉から DNA や RNA を抽出し、次世代シーケンシングを行う標準的な方法を使用します。Bioinformatic...

新しいウイルスのゲノムを発見する感染葉からの RNA の解析とウイルス粒子粗抽出 DNA の結合解析

呼吸合体ウイルス(RSV)RNA合成の詳細な機械分析のために、RNA非含核タンパク質(N0)をウイルス特異的ヌクレオキャプシド(NC)のその後のインビトロ集合体に対するRNAフリー核タンパク質(N0)の共発現にシャペロンホスホタンパク質(P)を利用するプロトコルを報告する。...

呼吸器間性ウイルスのウイルス特異的ヌクレオカプシドの生成と組み立て

学ぶヘルペスウイルスヌクレオカプシドDNAの抽出法。フレオン抽出と超遠心分離を用いて高純度のウイルスDNAを分離し、PCRやシーケンス解析に適したサンプルを調製する方法を解説する。

ヌクレオカプシドからウイルスDNAの調製

さらに動画を探す