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解剖されたショウジョウバエの胚をスライドガラスに固定し、テープで囲むことから始めます。
ハエの運動ニューロンは、視覚化のために蛍光標識されています。
顕微鏡を使用して胚を視覚化し、緑色の蛍光親油性色素を充填したマイクロピペットを胚の近くに配置します。
次に、蛍光モードに切り替え、運動ニューロンが筋肉に接続する神経筋接合部で運動ニューロンの軸索先端を見つけます。
明視野モードに切り替え、標的軸索の先端をピペットに接触させ、色素滴を放出してからインキュベートします。
親油性の性質と軸索の近傍により、色素は標的軸索の脂質に富む膜に選択的に入ります。
時間の経過とともに、色素は逆行性に移動し、軸索脂質二重層に沿ってニューロン体に向かって後方に移動し、ニューロンの突起にラベルを付けます。
スライドからテープを取り外し、カバーガラスを置きます。
共焦点顕微鏡でスライドを観察します。
逆行性標識された標的ニューロンは緑色の蛍光で現れ、詳細なニューロンの形態と突起を示します。
解剖顕微鏡下でガラス針を使用して、胚の内部組織を損傷しないように注意しながら、卵黄膜からテープからガラス上に胚を引き出します。次に、単一の胚の表面の正中線を後端から前端まで切り取ります。上皮組織を中心から反転させ、スライドガラスの表面に表皮の端を取り付けます。
先端の開口部が約300マイクロメートルのチューブ接続針を使用して、空気を吸引または吹き付けて、背側縦気管幹と残りの腸を除去します。4%PFAとPBSを使用して、オービタルシェーカーで室温で5分間胚を固定します。次に、PBSで3回洗浄します。
シアニン3色素と200マイクロリットルのPBSと結合した1マイクロリットルの抗西洋わさびペルオキシダーゼ抗体で胚をオービタルシェーカーで1時間染色します。そしてPBSで洗浄を繰り返します。注入用マイクロピペットを充填するには、キャピラリーホルダーに入れます。次に、染料スライドをステージに置き、マイクロマニピュレーターを使用してスライドの上に配置します。
次に、ステージを調整してマイクロピペットを色素の上に置きます。注入圧力を200〜500ヘクトパスカル、注入時間を0.1〜0.5秒、補償圧力を0に5分間設定して、色素とマイクロピペットを回収します。色素が採取されたら、色素スライドを取り外し、サンプルを顕微鏡ステージに置きます。
次に、補償圧力を30〜60ヘクトパスカルの範囲に上げ、マイクロピペットをサンプルに下げます。10倍対物レンズを使用して胚の位置を特定し、マイクロピペットを胚に合わせます。対物レンズを40倍水浸レンズに変更し、レンズをPBSに沈
めます。蛍光顕微鏡を使用して、抗HRP Cy3によってマークされたニューロンの形態をチェックし、注射部位を特定します。胚に焦点が合ったら、マイクロピペットの位置を変えて、目的の軸索の先端に優しく接触させます。次に、注入中に明視野顕微鏡を使用して色素滴を確認します。DiDまたはDiOのいずれかを使用して、ACCまたはRP3の神経筋接合部の右腹部半セグメントに色素を滴下します。
ハンドコントロールを使用して色素を放出し、マイクロピペットを取り外します。その後、次の注射部位に進みます。イメージング前に、サンプルをオービタルシェーカーで室温で1時間インキュベートします。細い鉗子を使用して、スライドガラスからテープを剥がします。
サンプルを取り付けるには、四隅に少量の真空グリースを入れたカバーガラスを準備します。気泡が入らないように慎重にサンプルの上に置きます。カバーガラスを押し下げて、対物レンズとスライドの間の作動距離を確保するためにサンプルからのスペースを調整します。
タスクワイプで余分なPBSを取り除きます。カバーガラスの端をマニキュアで完全に密閉します。共焦点顕微鏡で10倍、100倍の倍率で画像化し、ImageJソフトウェアで画像を処理します。