マウス脳切片における海馬ニューロン活性化のイメージング

ニューロンが豊富な背側海馬を露出させるマウスの脳切片から始めます。

過酸化水素を加えてニューロンのペルオキシダーゼ活性を消光し、洗浄します。

透過処理バッファーで処理し、ブロッキングバッファーを適用して非特異的結合をブロックします。

一次抗体を加え、攪拌しながらインキュベートします。これらの抗体は、ニューロン活性化マーカータンパク質に結合します。

ビオチン結合二次抗体を洗浄して塗布し、一次抗体に結合します。

すすぎ、複合体上のビオチンに結合するアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体を導入します。

再度洗浄してから、発色基質を加え、ペルオキシダーゼによって酸化されて茶色の沈殿物を生成します。PBSで反応を停止します。

切片をゼラチンでコーティングしたスライドに移し、濃度を上げたエタノールを使用して脱水します。次に、キシレンのセクションをクリアして取り付けます。

スライドを明視野顕微鏡下に置きます。

光の照射下では、染色されていない領域は光を透過して明るく見えますが、染色されたニューロンは光を吸収して反射して暗く見えます。

はっきりとした暗い領域は、海馬内のニューロンの活性化を示します。

各マウスの3〜5個の背側海馬切片を、各ウェルに500マイクロリットルの0.1モルPBSを含む24マルチウェルプレートのウェルに移します。各ウェルに含まれる切片を500マイクロリットルの0.1モルPBSで洗浄します。特に明記されていない限り、すべての洗浄とインキュベーションは室温で穏やかに撹拌して行ってください。ヒュームフードの下で、内因性ペルオキシダーゼ活性を消光するために、40%メタノール、0.1モルPBS中の1%過酸化水素で切片を20分間インキュベートします。

0.1モルPBSでさらに3回洗浄した後、切片を500マイクロリットルの0.2%Triton X-100で5分間インキュベートして透過性化します。切片がインキュベートしている間に、実験全体に十分なブロッキングバッファーを準備します。次に、透過処理溶液を除去し、各ウェルに100マイクロリットルのブロッキングバッファーを加えます。セクションを1時間インキュベートします。

次に、ブロッキングバッファーを取り除き、ブロッキングバッファーで1〜500に希釈したリン酸化細胞外調節キナーゼ一次抗体で切片を覆います。セクションを摂氏4度で穏やかに攪拌しながら一晩インキュベートします。翌日、切片を0.1モルPBSでそれぞれ5分間3回洗浄した後、1〜250ブロッキングバッファーで希釈したビオチン結合二次抗体とともに室温で1時間インキュベートします。

インキュベーション中は、アビジンとビオチンの複合体が形成されるのに十分な時間を確保するために、使用の少なくとも30分前にABC試薬を準備してください。切片を0.1モルPBSでさらに3回洗浄した後、ABC試薬を加え、サンプルと45分間インキュベートします。PBSでの次の3回の洗浄セット中に、メーカーの仕様に従ってヒュームフードで軽くたたく作業溶液を準備します。プレートに軽くたたく作業溶液を分注します。

次に、切片をDAB作業溶液を含むウェルに移し、プレートをゆっくりと回転させて、切片を溶液に最大限にさらします。約2〜5分で適切なシグナルが発生するまで、顕微鏡でDAB反応を監視します。組織を0.1モルPBSで洗浄することにより、所望の色強度で反応を停止します。PBSでさらに3回洗浄した後、切片をゼラチンでコーティングされたスライドに取り付け、室温で少なくとも3〜4時間乾燥させます。

自然乾燥したら、スライドをヒュームフードに移し、切片を段階的なエタノール溶液にそれぞれ2分間順次入れて脱水します。次に、スライドを100%キシレンで5分間クリアします。取り付け媒体を使用してスライドを覆い、ヒュームフードに一晩置いて乾燥させます。

スライドを20倍対物レンズのカメラを備えた明視野顕微鏡に移します。各セクションから背側海馬をカバーする200倍の倍率で複数の明視野画像を取得します。各動物から3〜5つのセクションを画像化します。