マウス網膜のTwo-Photon In Vivoイメージング

マウス網膜のin vivoイメージングのために、頭をホルダーに斜めに固定した麻酔トランスジェニックマウスを取ります。

網膜には、蛍光色素タグ付きタンパク質を発現する網膜神経節細胞(RGC)が含まれています。

目の潤滑剤を塗布し、目の上にカバーガラスを取り付けます。

顕微鏡下で、網膜を均一に照らして、RGCの蛍光タンパク質を励起します。

放出された蛍光を使用して、焦点面RGCと焦点が合っていないRGCの広視野を取得します。

2光子イメージングモードに切り替えて、低エネルギーの近赤外光をRGC層に集束させます。

焦点では、2つの光子からの結合エネルギーが蛍光団を励起し、蛍光団は蛍光としてエネルギーを放出します。

励起が1点に限定されるため、他の焦点面からの蛍光は最小限に抑えられます。

z軸に沿った複数の焦点面で画像をキャプチャして、RGCレイヤー全体を画像化します。

マウスの両目に潤滑剤の点眼薬を塗布します。片目の瞳孔が光路と一直線になるまでヘッドホルダーのメインアームを回転させ、1.5番のカバーガラスをコンパクトなフィルターホルダーに入れます。ホルダーを顕微鏡ステージに固定した後、角膜に触れずに潤滑剤i-gelに接触するまでカバーガラスを下げます。そして、広視野励起光が角膜を完全に覆うまで、ステージをxy次元と対物レンズのz位置に調整します。

接眼レンズを使用して、網膜の蛍光細胞または構造に焦点が合うまでz位置を調整し続け、必要に応じて落射蛍光照明器を増やして、目的の個々の細胞または構造を分解します。網膜とイメージング光路のアライメントを微調整します。焦点面を変更するときに、焦点が合っていない光の拡大または収縮のみが発生するまでヘッド角度を調整し、xy歪みを最小限に抑えます。

次に、落射蛍光照明器をオフにし、照明器のシャッターを閉じます。2 光子イメージングの場合は、すべての施設のレーザー安全プロトコルに従ってください。周囲光をすべて消して覆い、励起光路をレーザーに、発光光路をPMTに切り替えます。

画像取得ソフトウェアで、フレームサイズを512×512に、フレーム平均を3に設定します。zステッピングをスタックの最上部から開始して下向きに進行するように設定し、光受容体の2光子レーザーの活性化を最小限に抑えます。PMTをオンにして有効にし、電圧を680ボルトに調整します。

イメージングシャッターとエミッションシャッターを有効にします。1%のレーザー出力からターゲット組織のライブ画像プレビューを開始し、ディスプレイの明るさを自動調整して、目的の細胞または構造を視覚化します。ターゲット組織が薄暗いか不明瞭な場合は、45ミリワットを超えずに構造が見えるようになるまでレーザー出力の割合を上げます。

顕微鏡ステージをxy方向に操作して目的のイメージング領域を中心にし、目的の構造に焦点を合わせてz平面に移動します。慢性的なタイムラプス実験では、以前に取得した画像を開いて、現在の画像のイメージング角度が前の画像のイメージングの角度と似ていることに注意して、目的の細胞の参照として使用します。次に、対象の最上端と最下部のZ平面に移動して、イメージングスタックのzリミットを設定し、画像を取得します。