JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 4:02 分 • April 28th, 2025
円形のガラスイメージングウィンドウと頭蓋骨に埋め込まれたヘッドプレートを備えた麻酔をかけたトランスジェニックマウスから始めます。
ミクログリアまたは免疫細胞とニューロンは蛍光タンパク質で標識されています。
次に、マウスを2光子顕微鏡ステージに固定します。
次に、蛍光色素を腹腔内に注入して血管を赤く染色します。
ガラスのイメージングウィンドウを清掃し、生理食塩水滴を塗布し、顕微鏡の対物レンズを下げます。
次に、血管の画像をキャプチャするようにレーザー光を設定します。分岐パターンと座標を記録して、後で同じ領域を見つけて画像化します。
次に、蛍光タンパク質を励起し、ミクログリアとニューロンに蛍光を発するようにレーザーを設定します。
記録された分岐パターンを使用して、同じ領域を特定し、細胞の画像を定期的にキャプチャします。
血管ネットワークとニューロンは安定したままですが、時間の経過に伴うミクログリアの位置の変化は、ニューロンの活動に応答した免疫動態を反映しています。
歯科用ドリルビットを使用して、頭蓋骨に約4ミリメートルの円形の開口部をドリルで開けます。穴あけ中は、定期的に滅菌生理食塩水と綿棒で頭蓋骨を湿らせて脳を冷やします。骨の破片を取り除き、頭蓋骨を柔らかくします。
終わったら、先のとがった鉗子で頭蓋骨のこの部分を慎重に取り除きます。頭蓋骨を取り除いた後、生理食塩水で湿らせた小さなカバーガラスを開頭術に慎重に置きます。滅菌ワイプを使用して余分な生理食塩水を乾かします。先のとがったアプリケーターを使用して、窓の周りにシアノアクリレート接着剤を塗布し、脳と頭蓋骨に付着させます。
プライマー接着剤を頭蓋骨の残りの部分に塗布し、硬化ライトで20〜40秒間硬化させます。最終的な接着剤で窓の周りに井戸を作り、硬化ライトで20〜40秒間硬化させます。プライマー接着剤で開頭術の反対側半球の頭蓋骨に小さなヘッドプレートを接着し、次に最終接着剤で両方を20〜40秒間硬化させます。
マウスが目覚めた後、術後鎮痛としてブプレノルフィンSRを皮下投与1回注射し、72時間十分です。健康な回復を促進するために、マウスに余分な柔らかい食べ物を与えます。画像検査は、移植手術の2週間後から行うことができます。ネジを使用してヘッドプレートを2光子顕微鏡ステージに取り付けますが、加熱プレートで摂氏35度に維持する必要があります。
ローダミンBなどの100マイクロリットルの血管色素をマウスに皮下注射します。70%エタノールを軽くたたいた綿棒で頭蓋窓の表面を優しく洗浄します。窓に数滴の水または生理食塩水を置き、対物レンズを溶液に下げます。対物レンズが下がっているときにレーザーがオフになっていることを確認してください。
接眼レンズを通して見ながら、主要な血管のランドマークを示すコースマップを手描きします。この図面を使用して、2 つの光子イメージング中に特定の領域を識別します。2つの光子イメージングを使用して、蛍光細胞と血管の画像を収集します。イメージングパラメータについては、テキスト原稿を参照してください。適切な座標で注意深くメモを取り、その後のイメージングのために正確な領域を再確認できるようにします。
この最初のイメージングセッションでいくつかの視野を収集します。