トランスジェニックマウスの横隔膜の神経筋接合部におけるカルシウム動態の蛍光イメージング

トランスジェニックマウスの横隔神経を備えた固定化された横隔膜を含む蛍光顕微鏡セットアップから始めます。

横隔膜の神経筋接合部は、運動ニューロン、筋線維、およびアセチルコリン受容体とカルシウムチャネルを含むシュワン細胞で構成されています。

これらの細胞は、蛍光標識されたアセチルコリン受容体を持ち、細胞内カルシウム指示薬を発現します。

セットアップに取り付けられた画像スプリッターにより、両方の蛍光シグナルを同時に視覚化できます。

横隔神経は吸引電極に配置され、電気刺激を送ります。

蛍光顕微鏡下で、アセチルコリン受容体を視覚化して、神経筋接合部を特定します。

最大ベースライン蛍光を設定するには、塩化カリウム溶液を加えて細胞膜を一時的に脱分極します。これにより、細胞内カルシウムの流入が引き起こされ、インジケーターの蛍光が増加します。

蛍光信号の過飽和を防ぐために、明るさの設定を調整します。

再分極後、電気刺激を加えて細胞へのカルシウム流入を引き起こし、細胞内蛍光の変化を高いフレームレートで記録します。

20倍の倍率で、緑黄色の光励起下で蛍光標識されたα-ブンガロトキシン神経筋接合部を探して、筋肉の中心にある終板バンドを見つけます。青色光励起に切り替えて、筋肉、運動ニューロン、またはシュワン細胞のカルシウム応答を画像化します。この例では、GCaMP3は筋細胞で発現しています。

必要に応じて、バンドパスフィルターとダイクロイックシングルエッジフィルターを使用してイメージスプリッターをセットアップし、デュアル波長イメージングを行います。塩化カリウムに応答してビニングすることなく、遺伝的にコードされたカルシウム指示薬発現組織が20倍の倍率で飽和を示すレベルの110%に設定して、ルックアップテーブルバーの明るさバーを使用して実験を実行します。

毎秒20フレームで録画し、高速イベントを見逃さないようにします。吸引電極を使用して一連のインパルスを送達することにより、20〜40ヘルツの神経刺激の1〜45秒で刺激します。そして、静的蛍光標識されたα-ブンガロトキシン神経筋接合部シグナルとともに、1つの細胞サブタイプで動的な蛍光カルシウム応答を収集します。